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[size=4]化学发光法的灵敏度很高,超过一般的检测方法。其不足支出在于选择性较差,因此常与分离工具结合(HPLC, CE),能发挥很好的作用,但是联用技术的兼容性问题有很多需要考虑的地方,限制了该方法在实际中的应用。以下内容是拷自我以前的论文,主要讨论HPLC-CL联用技术需要注意的地方,供参考。要获得好的分离和灵敏的检测,往往需要综合考虑各方面的因素:(1)流动相的选择应与化学发光检侧系统相兼容,选择的溶剂既不应增加背景,也不应熄灭化学发光信号;此外,还要考虑发光试剂在其中的溶解度,以避免生成沉淀。(2)缓冲溶液及其pH值的选择。由于pH值对化学发光反应的发光强度ICL和寿命影响很大,选择合适的pH值十分重要,加缓冲溶液使流动相和反应试液均得到缓冲的方法,可控制一定的pH值;为适应不同的pH值范围,应选用合适的化学发光试剂。(3)选择适宜的流速,以保证分离完全并能检测到强的发光信号。(4)发光试剂浓度的选择应有利于提高信噪比(S/N)。一般,浓度大时可获得较大的发光强度,但浓度大,有时会形成沉淀,且增加干扰(背景噪声)。(5)所用试剂应纯化,以减小化学发光的背景。(6)输液泵的脉动会引起试液浓度的局部变化,提高背景噪声,故要保证尽可能均匀、恒定、无脉动流速输液。使用注射泵,但其容量有限,实际上多用往复泵,后接阻尼器以减小脉动。(7)化学发光检测器的设计应能检测到最大的ICL,死体积要小,且价格便宜、仪器简单、易于操作,分析速度快。为此,应使用短的混合反应管和高效光收集装置(如高质量光电倍增管及光子计数器的使用),并使流动池F尽量靠近光电倍增管。目前,微孔柱HPLC的应用日益广泛。在微孔柱的HPLC-CL分析中,流动相的流速相对于化学发光试剂的加入速度低很多,使流动相对反应池中最终的化学发光反应的影响很小,从而可使化学发光检测和HPLC分离有可能在各自的最佳条件下进行。这一点对梯度洗脱过程中的化学发光检测尤为重要。在使用化学发光检测时,可以选用反应速度快的发光体系,使柱后流出的分析物在没有明显扩散之前就完成了化学发光反应,避免了大体积池对色谱峰的展宽。微孔柱HPLC与快速灵敏的化学发光反应结合,为分离检测提供了一个完美的统一。为简化反应系统,可将反应试剂固定在固相担体上,装入短柱内,样品液流过短柱时发生反应。如将TCPO固体和固定化荧光试剂填装在短柱中,并与化学发光流动检测池相联,当流动相带着样品流过固相化学发光反应器及流动池时,即可测得化学发光信号。这种液固反应体系的优点是简单、稳定、不需附加输液泵等装置;缺点是柱寿命有限。将这种固相化学发光反应器与高效、高选择性的固定化酶反应器或光化学反应器相结合,特别适合于生化物质的测定。[/size]
我国检验医学技术的发展长期落后于世界先进水平,这极大地阻碍了我国临床检验和诊断产品的产业化。随着国家的改革开放,引进外资、引进技术,加快了诊断试剂产业化进程,提高了临床应用及诊断水平。但引进的往往是较落后的非主流技术和产品,而关键技术依然被少数发达国家垄断着。在上世纪90年代初期,国内诊断试剂的厂家虽然众多,可是产品品种单一,造成市场竞争白热化,产品质量参差不齐。由于低水平的产品重复研发,国内诊断产品企业在基础技术方面投入较少,具有自己的专利和自主知识产权的企业凤毛麟角,因此国内诊断试剂产品在与进口产品的竞争中远远处于劣势。 在20世纪90年代开始推广的磁微粒分离酶联定量检测分析克服了普通微孔板酶联免疫分析(ELISA)的缺点,成为全球广泛应用在磁微粒化学发光免疫分析的基础技术。1999年我国引进了磁微粒分离酶联定量检测分析的先进生产技术,通过引进、消化吸收,在此基础上自行研制、开发出磁微粒分离化学发光免疫分析试剂。项目被列为了国家“十一五”国家“863”计划重点项目,得到国家的全方位的支持。使得我国免疫试剂产品的再创新和自主创新能力进一步提高,形成了拥有自主知识产权的体外免疫诊断试剂,在方法学上的先进程度和产品质量均接近国际先进水平。它克服了放射免疫分析的高污染、有效期短和普通微孔板酶联免疫分析精密度差、灵敏度差的缺点,使用碱性磷酸酶——APS-5化学发光系统、磁微粒分离系统、独特的蛋白质保护技术,使得本项目方法的灵敏度、精密度、稳定性、有效期、安全性、环保性能大大提高。 化学发光免疫分析技术是继放射免疫技术、酶免技术、荧光免疫技术和时间分辨荧光免疫技术之后发展的一项新兴免疫分析测定技术。化学发光具有荧光的灵敏性,同时不需要激发光,避免了荧光分析中激发光、杂散光等背景荧光的影响,有很高的灵敏度,避免了放射免疫分析给操作者带来的健康隐患和对环境的污染。此项技术在体外免疫诊断试剂上的应用是先进的、科学的,可以说是非常理想的检测方法,也是国际主流技术之一。目前,国家已将使用该技术的部分产品列入行业标准中并推广使用。 化学发光免疫分析技术拥有众多的优点和特性,是其他方法不可代替的。目前在市场上的认可度也明显提高,已经逐步占据主导地位。我国掌握的磁微粒化学发光分析技术与国际主流的技术相当,但在临床诊断和应用上与国外进口产品还有较大的差距,如产品数量少,自动化程度低等。因此,重视产业化进程,提倡拥有自主知识产权,加强配套全自动化仪器的研发,加快与国际主流诊断技术接轨,已成为国内体外免疫诊断产品行业发展的迫切需求,具有重要的战略意义。(转自:http://www.fswenxiu.com/)
化学反应过程中的能量以光的形式释放出来,成为化学发光,有些生物体在能量代谢的过程中通过消耗ATP也可发光,为生物发光。化学发光 常用物质包括二氧乙烷衍生物、鲁米诺及衍生物、和丫啶酯。这些试剂可用于各种标本分析、HPLC检测和流动注射分析系统。二氧乙烷衍生物在碱性磷酸酶的作用下水解,形成一种高能量的中间体,这种中间体进一步分解后释放出光子,此类有代表性的物质是AMPPD和CSPD。此方法最为广泛的应用是基于碱性磷酸酶和β半乳糖苷酶的分析系统。碱性磷酸酶(AP)的测定 检测AP,β-葡糖苷酸酶活性的方法是使用一种有商品供应的稳定的1,2-二氧乙烷衍生物,这种发光底物的发光时间为数分钟至数小时。发光强度直接与酶的浓度相关。这种底物可用于1) 微孔板的免疫分析,DNA 探针捕获法和报告基因分析法, 2) 用于蛋白质和核酸分析的96-孔斑点膜。鲁米诺 是一种最古老的和最常用的试剂,在碱性条件下可被过氧化物氧化,同时发光,鲁米诺和过氧化物之间的氧化还原反应需要催化剂,这种催化剂一般为多价金属离子、过氧化物酶如铁、辣根过氧化物酶等,此种方法常用于检测过氧化物、重金属、过氧化物酶的含量,以及由此衍生的检测自由基、进行毒物分析和基于过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的分析方法。丫啶酯及衍生物 在碱性条件下可产生瞬时发光,将其作为标记物,已广泛用于免疫分析和分子杂交。