等离子体共振显微镜

Arctis 冷冻等离子体聚焦离子束专为自动化冷冻电子断层扫描成像样品的制备而设计。用户可以稳定地在原位制备厚度约为 200nm 或更薄的冷冻薄片，同时避免产生镓 (Ga) 离子注入效应。与目前市场上的其他 cryo-FIB-SEM 系统相比，Arctis Cryo-PFIB 可显著提高样品制备通量。与冷冻透射电镜和断层成像工作流程直接相连通过自动上样系统，Thermo Scientific&trade Arctis&trade Cryo-PFIB 可自动上样、自动处理样品并且可存储多达 12 个冷冻样品。与任何配备自动上样器的冷冻透射电镜（如 Thermo Scientific Krios&trade 或 Glacios&trade ）直接联用，省去了在 FIB-SEM 和透射电镜之间的手动操作载网和转移的步骤。为了满足冷冻聚焦离子束电镜与透射电镜应用的低污染要求，Arctis Cryo-PFIB 还采用了全新的高真空样品仓和经过改进的冷却/保护功能。Arctis 冷冻等离子体聚焦离子束电镜的主要特点与光学显微镜术关联以及在透射电镜中重新定位"机载"集成宽场荧光显微镜 (iFLM) 支持使用光束、离子束或电子束对同一样品区域进行观察。 特别设计的 TomoGrids 确保从最初的铣削到高分辨率透射电镜成像过程中，冷冻薄片能与断层扫描倾斜轴始终正确对齐。iFLM 关联系统能够在电子束和离子束的汇聚点处进行荧光成像。无需移动载物台即可在 iFLM 靶向和离子铣削之间进行切换。CompuStage的180° 的倾转功能使得可以对样品的顶部和底部表面进行成像，有利于观察较厚的样品。TomoGrids 是针对冷冻断层扫描工作流程而特别设计的，其上下2面均是平面。这2个面可防止载样到冷冻透射电镜时出现对齐错误，并始终确保薄片轴相对于透射电镜倾斜轴的正确朝向。 利用 TomoGrids，整个可用薄片区域都可用于数据采集。厚度一致的高质量薄片Arctis 冷冻等离子体聚焦离子束扫描电镜可在多日内保持超洁净的工作环境，确保制备一致的高质量薄片。等离子体离子束源可在氙离子、氧离子和氩离子间进行切换，有利于制备表面质量出色的极薄薄片。等离子体聚焦离子束技术适用于液态金属离子源 (LMIS) 聚焦离子束系统尚未涉及的应用。例如，可利用三种离子束的不同铣削特性制备高质量样品，同时避免镓注入效应。系统外壳的设计考虑到了生物安全，生物安全等级较高的实验室（如生物安全三级实验室）可选用高温消毒解决方案。Arctis 冷冻等离子体聚焦离子束扫描电镜的紧凑型样品室专为冷冻操作而设计。由于缩小了样品室体积，操作环境异常干净，最大限度减少水凝结的发生。通过编织套管冷却样品及专用冻存盒屏蔽样品，进一步提升了设计带来的清洁度，确保了可以进行多日批量样品制备的工作环境。 自动化高通量样品制备和冷冻断层扫描连接性自动上样器可实现多达 12 个网格（TomoGrids 或 AutoGrids）的自动上下样，方便转移到冷冻透射电镜，同时最大限度降低样品损坏和污染风险。通过新的基于网络的用户界面加载的载网将首先被成像和观察。 随后，选择薄片位置并定义铣削参数。铣削工作将自动运行。根据样品情况，等离子体源可实现高铣削速率，以实现对大体积材料的快速去除。自动上样系统为易损的冷冻薄片样品提供了受保护的环境。在很大程度上避免了可能会损坏或污染样品的危险手动操作样品步骤。 自动上样器卡槽被载入到与自动上样器对接的胶囊中，可在 Arctis 冷冻等离子体聚焦离子束扫描电镜和 Krios 或 Glacios 冷冻透射电镜之间互换。

SPRm 200 系列 表面等离子体共振和光学显微镜完美结合开辟研究细胞膜蛋白相互作用的新前沿 SPRm200是将表面等离子体共振技术和光学显微镜巧妙结合为一体的生物传感检测仪。它为免标记研究分子相互作用的领域开辟一个崭新的前沿。专门针对细胞膜蛋白和相关分子免标记检测而设计的SPRm200， 使您在不需要从细胞中提取和分离膜蛋白的前提下实时观察细胞结构并同时测量药物和靶点在细胞上的结合过程。还可进行对药物和在天然状态下的膜蛋白之间相互作用的测量。由于出色的灵敏度和稳定性，SPRm200能够测量纳米尺度上的结合行为，可用于研究细菌或病毒与抗菌性药物的相互作用，以及发展新型药物载递纳米颗粒。 活细胞上免标记生物分子结合过程的检测 实时亲合力及动力学定量测量像图 光学和表面等离子体共振同时成像 药物分子对多细胞或单细胞作用的检测 纳米尺度上分子结合过程的跟踪检测 Binding activities of Nano，materials (2um size) 光学显微镜与SPR技术的集成 SPRm200把SPR技术和光学成像结合起来，能够对活细胞成像并将药物分子结合反应定位分布图像实时地表征出来。如图1所示，明场聚焦光源照射于芯片表面固定的细胞，而底部的照相机实时捕获活细胞的图像。同时SPR光源沿共振角度投射于传感器芯片上，由SPRm200检测器测定反射光，并把每一个像素点上的SPR响应信号记录下来组建成SPR传感图。传统的SPR技术只能在大的整体传感区域内（通常称之为通道）测量平均共振角度的变化，而SPRm200检测器能够测量微小局部中的任何像素上的共振角度变化并且记录每一个像素上的传感曲线图。图2显示了SPRm200同时记录的明场和SPR图像以及图中任何一点或区域的传感曲线图。因此SPRM能提供更多的局部信息，并且可以在研究天然态下的膜蛋白的非均相表面结合过程以及它们和药物之间的相互作用。 对神经瘤细胞与WGA结合的实时检测：明视场与SPR的同步图像，右边是选择点的SPR传 感图。 凝集素- 糖蛋白相互作用研究细胞上的信号通道和药物筛选通常首先研究配体与膜蛋白的结合，而研究在天然状态下膜蛋白对于理解其生物功能至关重要。这里是研究糖蛋白（膜蛋白）和凝集素（配体）之间的特异性相互作用以及单个细胞膜上受体的结合活性和空间分布的一个实例。将神经瘤细胞SHEP1在芯片上培养或固定，然后置于SPRM样品台上。将PBS缓冲液在25度以300 μl/min的流速注入细胞池获得基线。当80μg/ml的小麦胚芽凝集素（WGA）被注入细胞室，仪器可以实时检测到传感曲线的结合段；而当PBS缓冲液冲洗时，仪器也可测量到解离段。每进行下一个浓度实验前，用50 mM GlcNAc 溶液来再生细胞表面上的膜糖蛋白受体。用不同的WGA浓度（5, 10, 40, 80,100, 200 μg/ml）重复对细胞的进行类似测量，则可以得到如图2右所示的一系列传感曲线图。将每个像素的数据予以平均后，可以使用一级结合动力学模型（参见下文）推导出细胞不同部位上的结合动力学参数。我们仪器测量结果与以前发表的数据十分吻合： nACHRs 的结合行为的定位nAChR膜受体在神经传递和尼古丁成瘾中起着关键作用，通常测定受体在细胞中的分布使用荧光标记的二抗。由于荧光检测不能提供直接的动力学数据而容易导致假阳性的结论，SPRm200因为直接测量一抗与不含二抗的nAChR的结合，该过程不仅更加简单，且克服了被标记的二抗所引起的不确定因素。 上图中，工程化SH-EP1细胞在膜上表达α4β2 受体，并结合初代抗体抗α4（右图）。通过SPR 像图所显示的nAChR 同其初代抗体结合的分布（粉红色），可以明显看出这是一个非均相的表面结合。用SH-EP1野生型细胞来作为对照， 传感曲线右下图A显示了两种类型的细胞对nAChR的反应具有显著差异。如传感图B中所示，从SH-EP1工程化细胞反应减去野生型细胞反应（主要出于体积折射率效应）可以得到nAChR与其第一抗体的结合动力学，它们分别为kon = 6×104/Ms，koff = 3×10-3/s 和KD=45nM。 纳米颗粒检测 在纳米尺度上，由一个纳米颗粒所产生的SPR响应信号非常独特。就好像把一个小石子放在一个缓缓流动的浅溪中，水面上就会产生一个波纹图案（参考下图）。SPR光源按共振角度投射到传感器芯片上使其产生一个沿着金属膜表面传播的表面等离子体(SP)波，如图3所示。当一个纳米颗粒结合到芯片表面时，它便成为SP波的发散点，因而会在SPR像中产生波纹图案。其形状远远大于纳米颗粒的实际尺寸（100 倍以上）。这放大的波纹图案使得SPRm200能够检测到粒子尺度远小于其光学衍射的极限，通过对这个放大的波纹图案进行跟踪和测量，就能实现对分子在纳米尺度下结合行为的研究。 细菌和抗生素大肠杆菌O157:H7 在LB肉汤培养基中通过抗体偶联被交联在传感器芯片上。他们因发散芯片中的SP波而在SPR像上产生许多点波纹如下图右边所示。 参考文献：K Syal, R Iriya, Y Yang, H Yu, S Wang, S Haydel, HY Chen, NJ Tao, "Antimicrobial Susceptibility Test with Plasmonic Imaging and Tracking of Single BacterialMotions on Nanometer Scale", ACS Nano, 10, 845-852, 2016F Zhang, S Wang, L Yin, Y Yang, Y Guan, W Wang, H Xu, NJ Tao, “Quantification of Epidermal Growth Factor Receptor Expression Level and Binding Kineticson Cell Surfaces by Surface Plasmon Resonance Imaging", Analytical Chemistry, 87(19), 9960-9965, 2015W Wang, L Yin, L G-M, S Wang, X Yu, S Eaton, S Zhang, H Chen, J LaBaer, NJ Tao, “In situ drug-receptor binding kinetics in single cells: a quantitative labelfreestudy of anti-tumor drug resistance”, Scientific reports, 4, 1-7, 2014W Wang, Y Yang, S Wang, V Nagaraj, Q Liu, J Wu and NJ Tao, "Label-free measuring and mapping of binding kinetics of membrane proteins in single livingcells", Nature Chemistry, 4, 846-853, 2012Wang, Shaopeng, et al. "Label-free imaging, detection, and mass measurement of single viruses by surface plasmon resonance." Proceedings of theNational Academy of Sciences 107.37 (2010): 16028-16032. 参数表：

SPRm 200 系列 表面等离子体共振和光学显微镜完美结合开辟研究细胞膜蛋白相互作用的新前沿SPRm200 表面等离子共振显微镜 工作原理基于表面等离子共振（SPR）技术。是将表面等离子体共振技术和光学显微镜巧妙结合为一体的生物传感检测仪。可以同时得到细胞原位明场成像、SPR成像、及SPR动力学曲线定量亲和常数、结合解离常数，它为免标记研究分子相互作用的领域开辟一个崭新的前沿。专门针对细胞膜蛋白和相关分子免标记检测而设计的SPRm200， 使您在不需要从细胞中提取和分离膜蛋白的前提下实时观察细胞结构并同时测量药物和靶点在细胞上的结合过程。还可进行对药物和在天然状态下的膜蛋白之间相互作用的测量，高分辨SPR成像，可以同时实现单个或多个细胞的研究，从而实现细胞与药物结合的异质性及统计学分析。由于出色的灵敏度和稳定性，SPRm200能够测量纳米尺度上的结合行为，可用于研究细菌或病毒与抗菌性药物的相互作用，以及发展新型药物载递纳米颗粒。（1）小分子药物（200Da）与单细胞结合筛选与分析（2）小分子药物（200Da）与多细胞/活细胞结合筛选与单个细胞精度统计学分布分析，研究细胞异质性差异（3）抗体药物与单个/多个活细胞结合筛选与单个细胞精度统计学分布分析，研究细胞异质性差异（4）细菌或病毒与抗菌性药物的相互作用（5）其他分子细胞/活细胞层面原位研究主要功能实时定量活细胞分子相互作用单个细胞/多个细胞动力学&定量分析（Ka，Kd，KD，C）及统计分布明场成像、SPR成像结合单点动力学分析生物标记检测, 药物靶向研发小分子免标分析（200Da）电化学同步分析小分子、DNA、抗体、肽段、蛋白、病毒、细菌、细胞技术特点细胞原位：真正实现细胞层面的原位分子互作，无需提纯，可以直接原位分析药物在细胞层面与分子互作，尤其为膜蛋白受体（糖蛋白、GPCR）等提供了研究解决方案；通量：SPR视场600um*600um，可以同时进行多个细胞与分子互作的研究，从而实现药物统计学分析，和细胞异质性研究精度：良好灵敏度，可以实现200Da 小分子药物与细胞的互作研究高分辨动态可视化：可以动态可视化观察药物分子与细胞反应的全过程及成像，同时可以得到定量的SPR分析曲线，从而得到定量Ka，Kd ，KD。高分辨率，1um SPR成像分辨，从而可以得到单个细胞的分辨成像与定量数据应用实例：基于原位细胞分子互作的研究小分子药物常用药物中，小分子药物可占总量98%，小分子药物通常是信号传导抑制剂，它能够特异性地阻断肿瘤生长、增殖过程中所必需的信号传导通路，从而达到治疗的目的。多通过浓度梯度提供动力被吸收。1. 小分子药物与HEK 293细胞GPR39受体相互作用图（a）SPR成像，亮暗反映不同细胞、不同区域的结合作用的强弱；图（b），明场成像，可以得到不同细胞的观察与选区；图（C）多个兴趣选区，每个区域的SPR信号曲线，图（e、f、g）分别为多个兴趣选区，亲和常数/解离常数/结合常数的统计分布：KD：413nM（42nM标准偏差），kd = 4.27E-3 s-1 (0.720E-3 标准偏差)，ka = 6.92E3 M-1 s-1 (0.721E3 标准偏差)2. 小分子药物与细胞ASIC 酸敏感离子通道受体相互作用研究抗体药物单克隆抗体（mAb）疗法已成为治疗癌症、自身免疫性疾病、哮喘和许多其他疾病的既定方法。单克隆抗体（mAb）药物占整个生物制药50%的份额，其中超过60%都是膜蛋白受体。SPRm200可以在单细胞层面定量研究单克隆抗体（mAb）和膜蛋白结合作用。传统SPR是直接将纯化的蛋白固定在芯片表面，对于膜蛋白而言是有问题的，膜蛋白从细胞环境中提取并保持自身形态非常困难。基于病毒、细菌载体分子互作的研究1.快速ASTs实验：抗生素与大肠杆菌（Live E.Coli O157.H7）代谢活性研究ASTs实验是确定抗生素易感性和细菌菌株耐药性的重要实验。目前大多数AST实验是基于细胞培养，需要几天时间才能完成。快速AST检测可以降低发病率死亡率和帮助制定早期窄谱抗生素治疗方案。通过SPRm200，我们使用等离子成像和PIT技术跟踪单个细菌细胞的运动。监测随着细胞代谢和抗生素的投入的Z向变化。可以看到，抗生素可以明显减弱细菌细胞的活动，并且可以定量计算，从而成为快速AST检测方法2. 基于SPRm200，病毒载体微阵列研究多种不同GPCR受体与配体的相互作用的研究SPRM电化学阻抗方法定量检测分子互作通过电化学SPRM阻抗分析，测量了传感器表面病毒肽配体和不同GPCR受体的结合动力学常数。