測量溶性溶液数显计

本文来源： 柯瑞斯质谱平台摘 要目的　 建立超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时快速检测微量血清中维生素A、维生素D(25-OH-VD2、25-OH-VD3)、维生素E(α-、β-和γ-生育酚)的方法。 方法　 血清中脂溶性维生素经甲醇-乙腈(50:50, v/v)沉淀蛋白、正己烷萃取，以Phenomenex Kinetex F5色谱柱为分离柱，2.5mmol/L甲酸铵-0.1%甲酸水溶液和甲醇为流动相，梯度洗脱，电喷雾电离(ESI~+)、多反应监测(MRM)模式下检测，同位素内标法定量。结果　 血清中6种脂溶性维生素线性范围内线性关系良好，相关系数r0.995；6种脂溶性维生素的检测限为0.20～1.25ng/mL，定量限为0.39～3.88ng/mL；加标回收率为86.6%～107.7%，日内精密度9.6%，日间精密度9.3%。NIST标准参照品SRM 968f验证方法准确度，结果偏差均在5%以内。结论　 本方法准确度高、重现性好、用血量少，适于婴幼儿等采血困难者微量血样中多种脂溶性维生素的同时快速检测。正 文维生素在人体生长代谢过程中发挥着重要作用，是人体必须的微量营养素，缺乏或过量都会对人体健康产生不利影响。维生素A、D、E是脂溶性维生素，研究表明缺乏这些维生素会增加患夜盲症、骨质疏松、心血管疾病及免疫系统相关疾病的风险[1],婴幼儿及未成年人缺乏其对生长发育的影响则更为明显[2-4]。目前维生素检测的方法主要有高效液相色谱法[5-7]、液相色谱-串联质谱法[8-14]等，其中液相色谱-串联质谱法因其灵敏度高、重现性好、可同时快速检测多种维生素已成为很多临床实验室的首选方法。但是目前的液相色谱-串联质谱方法血液需求量较大[10,13],检测项目单一[8-9,14]或检测时间较长[11],不能满足临床同时快速检测多个项目的需求，特别是婴幼儿采血困难采血量很难满足需求。虽然已有部分学者建立微量检测方法用于维生素检测，但是这些方法需要衍生化过程，前处理复杂耗时较长[8-9,14]。因此，建立能够用微量血液同时快速检测多种维生素的方法满足临床不同年龄段的检测需求显得尤为必要。此外，视黄醇，维生素D的代谢产物25-OH-VD2、25-OH-VD3,α-生育酚是脂溶性维生素A、D、E在血液循环中的主要存在形式，常作为脂溶性维生素检测的首选指标[15-18]。γ-生育酚是维生素E主要的饮食摄入形式，但其与α-生育酚转移蛋白(α-TTP)的亲和力较低，在体内含量较α-生育酚低，但是，近年来文献报道其在人体健康活动中也扮演着重要角色[19]。本文建立超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)同时快速检测微量血清中视黄醇，维生素D(25-OH-VD2、25-OH-VD3)和α-、β-、γ-生育酚的方法，满足临床各年龄段尤其是对婴幼儿同时快速检测多种维生素的需求。１实验部分１.１　 仪器与试剂　液质联用仪；高速冷冻离心机；涡旋振荡仪；超声波振荡器；氮吹仪(Agela)；紫外分光光度计。视黄醇、25-OH-VD2、25-OH-VD3、α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚均购自美国Sigma-Aldrich；视黄醇-d6标准品购自上海谱芬生物；25-OH-VD2-d3购自美国IsoSciences、25-OH-VD3-d6、α-生育酚-d6标准品购自加拿大TRC 血清质控样品购自美国NIST 收集安徽省第二人民医院近期健康体检正常儿童血液样本17份，避光保存。LC-MS级甲醇，色谱级乙腈、正已烷及甲酸均购自美国Fisher；甲酸铵、牛血清白蛋白(BSA)购自美国Sigma-Aldrich；色谱级乙醇购自国药集团。实验用水由Milipore纯水仪(美国密理博)提供。１.２　 标准溶液和内标溶液的配制　 用无水乙醇配制视黄醇标准品储备液100μg/mL；α-生育酚、β-生育酚、γ-生育酚标准品储备液各1000μg/mL，并用紫外分光光度计对其浓度进行校正[18,20]。用甲醇配制25-OH-VD2标准品储备液25μg/mL和25-OH-VD3标准品储备液100μg/mL，视黄醇-d6标准品储备液100μg/mL，25-OH-VD2-d3标准品储备液50μg/mL，25-OH-VD3-d6标准品储备液50μg/mL，α-生育酚-d6标准品储备液1000μg/mL。将各目标化合物标准储备液用复溶液(初始流动相)稀释混匀，配制成混合标准溶液(视黄醇2.50μg/mL、25-OH-VD2 0.20μg/mL、25-OH-VD3 0.40μg/mL、α-生育酚50.00μg/mL、β-生育酚5.00μg/mL、γ-生育酚 5.00μg/mL)；将各同位素标品储备液用甲醇稀释混匀，配制成混合内标工作液(视黄醇-d6 2.00μg/mL、25-OH-VD2-d3 0.10μg/mL、25-OH-VD3 0.20μg/mL、α-生育酚-d6 20.0μg/mL)。取4g BSA溶解于100mL水中配成4% BSA溶液。１.３　 样本前处理　 取血清样品20μL至2mL离心管中，加入10μL同位素内标工作液，80μL水，2000r/min涡旋振荡30s后加入200μL甲醇-乙腈(50∶50,v/v)，2000r/min混匀60s；加入800μL正己烷，2000r/min，混匀5min，然后4℃，12000r/min离心5min；吸取600μL上清液至1.5mL离心管中，室温下氮气吹干；加100μL初始流动相复溶，涡旋振荡60s，4℃，12000r/min离心5min，上清液转移至进样瓶中待分析。１.４　 色谱 － 质谱条件　 采用Phenomenex Kinetex F5(100mm × 2.1mm, 2.6μm)色谱柱，柱温35℃，流动相A含2.5mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸的水溶液；流动相B含2.5mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸的甲醇溶液，梯度洗脱程序：0～2.0min，70%B，2.0～2.5min，70%～88% B，2.5～3.5min，88% B，3.5～3.51min，88%～81%B，3.51～11.0min，81% B，11.0～12.0min，81%～70%B，流速0.5mL/min。进样量：20μL。采用多反应监测(MRM)、电喷雾正离子模式(ESI+)，离子源温度 150℃，脱溶剂温度500℃，毛细管电压3kV，脱溶剂气流速1000L/h；6种脂溶性维生素的MRM 离子参数见表1。２　 结果与讨论２.１　 前处理条件优化　 对血清前处理过程中蛋白沉淀剂(甲醇、乙腈、乙醇)的选择及萃取溶剂正己烷的用量(400μL、600μL、800μL)进行了优化，结果表明，甲醇-乙腈(50∶50,v/v)，沉淀效果最好，色谱图杂峰明显减少；正己烷用量较大时萃取更完全，信号值更高。另外，考察了不同复溶液体系：甲醇-水(50∶50,v/v)、甲醇-水(70∶30,v/v)、甲醇均含2.5mmol/L甲酸铵和0.1%甲酸对色谱分离的影响，结果如图1所示，使用b组复溶液即初始流动相时视黄醇响应值较a组增加1倍以上，c组视黄醇峰宽变大且峰形不对称。同时b组中25-OH-VD3和25-OH-VD2响应值是a组的2倍、c组的4倍以上，且峰形明显改善有利于25-OH-VD3和 25-OH-VD2的分离检测。最终，采用血清样加水混匀后用200μL沉淀剂(甲醇：乙腈(50∶50,v/v)沉淀蛋白，800μL正已烷液液萃取，取600μL上清液氮吹，初始流动相复溶进样。２.２ 　 液 相 色 谱 条 件 优 化 　 Kinetex F5色谱柱可以实现所有组分包括β、γ-生育酚的分离。此外，25-OH-VD3同分异构体3-epi-25-OH-VD3在婴幼儿体内含量较高，对维生素D含量测定影响较大[21]，该色谱柱可以实现25-OH-VD3和3-epi-25-OH-VD3的分离，减少3-epi-25-OH-VD3对检测结果的影响。故采用Kinetex F5色谱柱进行所有组分的分离(见图2)。研究发现在流动相中加入甲酸铵后其促进目标化合物离子化的效果较加入乙酸铵好，响应值增加明显，故在水相和有机相中均加入2.5mmol/L甲酸铵。２.３　 线性范围、检出限和定量限　 将混合标准溶液用复溶液逐级稀释，得到一系列标准工作液，各取20μL，分别加入10μL内标工作液和80μL 4% BSA溶液，其余操作同样本前处理。由于人血中存在内源性脂溶性维生素，故在标曲制作中加入4% BSA。以各目标化合物的色谱峰与其相对应的同位素内标色谱峰的峰面积比值-浓度比值作图，得到各目标化合物的标准系列工作溶液的直线拟合方程，并计算相应的线性相关系数。6种脂溶性维生素的标准曲线和线性范围见表2。结果表明，6种脂溶性维生素在对应的浓度范围内线性关系良好，相关系数0.995，标准溶液色谱图如图3所示。每个浓度重复检测6次，满足相对标准偏差20%且信噪比S/N≥3的最低浓度值定为检测限，满足相对标准偏差20%且信噪比S/N≥10的最低浓度值定为定量限。6种脂溶性维生素检测限为0.20～1.25ng/mL，定量限为0.39～3.88ng/mL(见表2)。２.４　 方法精密度　将低、中、高三个浓度标准品溶液加入4% BSA混合血清样本经本法处理后进行检测，每个浓度重复6次，连续检测三天，计算日内精密度为0.9%～9.6%，日间精密度为3.0%～9.3%(见表3)。该方法同时测定6种脂溶性维生素的日内精密度和日间精密度均在15%以内，方法精密度满足检测需求。２.５　 方法准确度　 将低、中、高浓度的标准品溶液加入混合血清样本中按本法进行前处理后进行检测，每个浓度重复6次，计算加标回收率，3个水平的加标回收率为86.6%～107.7%，相对标准偏差(RSD)为1.46%～9.39%(见表4)。该方法加标回收率均在80%～120%以内，方法准确度高满足检测需求。２.６　 方法验证　 采用建立的UPLC-MS/MS方法对美国国家标准技术研究所(NIST)制定的标准参照品SRM 968f进行检测，每个水平重复2次取平均值，验证方法准确度。结果表明，除25-OH-VD2含量较低未能检出外，其它检测结果与靶值偏差均在5%以内，该方法检测结果准确可靠(表5)。２.７　 实际样品测定　 使用本方法对17份健康儿童血液样本进行检测，其中视黄醇含量为0.22～0.43μg/mL，25-OH-VD2含量为未检出～5.19ng/mL，25-OH-VD3含量为6.83～49.21ng/mL，α-生育酚含量为5.63～12.73μg/mL，β-生育酚含量为0.03～1.37μg/mL，γ-生育酚含量为0.11～1.68μg/mL。本法适用于微量临床血液样本6种脂溶性维生素的同时快速检测。３结　 论本研究建立了超高效液相色谱串联质谱法同时测定微量血清样本中多种脂溶性维生素的方法，并对前处理过程中的蛋白沉淀试剂、萃取液用量，复溶液等进行了优化，以减少色谱图中噪音干扰，改善色谱峰形，提高检测灵敏度。并比较了不同色谱柱对多种脂溶性维生素尤其是不同类型维生素E的分离效果，最终选择Phenomenex Kinetex F5色谱柱，该色谱柱可以实现β-生育酚和γ-生育酚的有效分离。本研究中只需20μL血清就能够快速完成6种脂溶性维生素的测定。该方法测定样本需求量少、操作简单、检测结果准确快速可实现大量临床样本的同时检测，尤其对采血较为困难的婴幼儿可以实现少量血液样本检测多数项目的需求。参考文献（略）本文引用来源： 李雪梅,吴慧慧,陈竞,赵盼,唐玉菲.超高效液相色谱-串联质谱法同时快速检测微量血清中6种脂溶性维生素[J].现代预防医学,2022,49(07):1297-1302.

2023注射剂注册评审及一致性评价培训班于6月8日—11日在北京成功举行。此次活动通过培训方式，帮助参训学员准确掌握注射剂产业最新监管政策、审评技术等动态，并针对《中国药典》对注射剂产业高质量发展相关的质量要求和检验方法作出交流活动。此次会议由国家药品监督管理局主办，邀请中检院首席专家胡昌勤教授、沈阳药科大学博士生导师袁红梅教授等业内知名专家学者进行授课。海岸鸿蒙窦晓亮博士在6月10日下午分享的“不溶性微粒检查光阻法的检测与校准，可见异物自动检查设备的确证方法”主题内容，受到参训人员的认可。可见异物/不溶性微粒 医药企业的持续挑战生物医药领域作为21世纪最具发展前景的领域之一，随着药物质量研究的深入以及患者依从性需求的提高，注射给药途径逐渐趋于主流，注射产品是当如今全球生物制药市场发展中的主要增长引擎。目前，美国FDA批准的药物中有40%以上是可注射的皮下和肌肉注射产品，注射产品在这些批准的药物中所占的比重正越来越大。注射剂产品正经历飞速发展，但产品质量问题同样不可忽视，国内外因产品因质量问题而召回的事件频频发生，其中因颗粒异物问题被召回处于前列。如西班牙ROVI制药公司生产的COVID-19疫苗产品存在可见异物问题，美国费森尤斯卡比频繁出现产品因可见异物的因素召回产品，福建某药业生产的注射液一年内被两次检出可见异物，黑龙江某制药厂生产的葡萄糖注射液产品内有可见异物……颗粒异物问题作为生物医药界常见且极具挑战性的问题，它直接影响生物药的安全性和有效性。一旦产品中出现不符合监管要求的异物颗粒，会导致危机患者生命安全及产品召回等后果。因此，如何避免由于异物颗粒导致的安全影响，是企业面临的持续挑战，加强药品的质量管理，则是企业永恒的责任。海岸鸿蒙标准物质 助力药企质量管理随着临床上注射剂的大量使用，由注射剂中不溶性微粒引起的临床不良反应案例不断发生，国内外药典等对注射剂中微粒进行了严格的控制。《中国药典》2020年版（ChP 2020）、《美国药典》43-国家处方集 38（USP 43-NF 38）、《欧洲药典》10.0（EP 10.0）、《英国药典》2021（BP 2021）和《日本药典》18（JP 18）都对不溶性微粒和可见异物有明确规定，均采用光阻法和显微镜法进行检测。以中国药典为例，不溶性微粒可以通过光阻法和显微计数法两种方法测量，其中光阻法的判定标准为：（1）标示装量为100mL或100mL以上的静脉用注射液除另有规定外，每1mL中含10μm及10μm以上的微粒数不得过25粒，含25μm及25μm以上的微粒数不得过3粒。（2）标示装量为100mL以下的静脉用注射液、静脉注射用无菌粉末、注射用浓溶液及供注射用无菌原料药除另有规定外，每个供试品容器（份）中含10μm及10μm以上的微粒数不得过6000粒，含25μm及25μm以上的微粒数不得过600粒。除了明确的颗粒数量要求，《中国药典》中规定仪器的校准所用仪器应至少每6个月校准一次。做好药品可见异物/不溶性微粒的风险控制，是确保药品安全性和有效性的重要措施。海岸鸿蒙深耕标准物质领域二十七载，颗粒标准物质的研发已经达到国内领先、国际先进水平，可见异物等百余种标准物质的研制成功填补国内空白，并可提供特殊定制服务。海岸鸿蒙更将作为生物医药企业的合作伙伴，为生产中的质量管理，减少异物颗粒提供有效保障，助力企业在不断变化的市场状况下应对新的挑战。

石油产品水溶性酸及碱测定仪使用方法、安装A1181技术指导产品介绍产品名称：石油产品水溶性酸及碱测定仪产品型号：A1181概 述：本仪器用蒸馏水或乙醇水溶液抽提试样中的水溶性酸及水溶性碱，然后，分别用甲基橙或酚酞指示剂检查抽出液颜色的变化情况，或用酸度计测定抽提物的pH值，以判断有无水溶性酸或水溶性碱的存在。适用于按GB/T 259所规定的方法测定液体石油产品、添加剂、润滑脂、石蜡及含蜡组分的水溶性酸及水溶性碱。使用方法1、当试验液体石油产品时，将50 ml试样和50 ml蒸馏水放入烧瓶，加热试样至50～60℃，倒入分液漏斗。然后轻轻摇动分液漏斗5min，不许乳化，放出澄清后下部的水层，经滤纸过滤后，滤入锥形烧瓶中。2、当试验添加剂产品时，向分液漏斗注入10 ml试样和40 ml溶剂油，再加入50 ml加热至50～60℃的蒸馏水。将分液漏斗摇动5min，澄清后分出下部的水层，经有滤纸的漏斗，滤入锥形烧瓶中。3、若石油产品用水混合后产生乳化时，则用50～60℃、1:1的95%乙醇溶液代替蒸馏水处理。4、当试验润滑脂、石蜡、地蜡及含蜡组分产品时，取50克预先熔化好的试样，将其置入瓷蒸发皿中，然后注入50 ml蒸馏水，并煮沸至完全熔化，冷却至室温后，将下部水层经有滤纸的漏斗，滤入锥形烧瓶中。5、用指示剂测定水溶性酸或水溶性碱：向两个试管中分别放入1～2ml抽提物，在第一支试管中加入2滴甲基橙溶液，并将它与装有相同体积蒸馏水和甲基橙溶液的第三支试管相比较。如果抽提物呈玫瑰色，则表示所试石油产品里有水溶性酸存在。在第二支盛有抽提物的试管中加入3滴酚酞溶液，如果溶液呈玫瑰色或红色时，则表示所试石油产品里有水溶性碱存在。当抽提物用甲基橙溶液或酚酞溶液为指示剂，没有呈现玫瑰色或红色时，则认为没有水溶性酸或水溶性碱。6、用酸度计测定水溶性酸或水溶性碱：向烧杯中注入30～50ml抽提物，电极浸入深度为10～12mm，按酸度计使用要求测定pH值，根据下表确定试样抽提物水溶液或乙醇水溶液中有无水溶性酸或水溶性碱。石油产品水（或乙醇水溶液）抽提物特性pH值1酸性4.52弱酸性4.5～5.03序号5.0～9.04弱碱性9.0～10.05碱性10.0用酸度计测定时同一操作者两结果之差不应大于0.05pH，取重复测定两个pH值的算术平均值作为试验结果。警告：仪器若出现故障应及时切断电源，请专业技术人员检修并排除故障后方可继续使用，防止发生意外！安装1、取出可调电热器，置于平整、耐高温、阻燃的工作台或平板上，按照图示和以下步骤安装仪器。2、将支架杆和固定台按图安装好，拧紧螺钉固定。3、将冷凝管夹持器在支架杆的合适位置，用管夹夹住分液漏斗。4、在分液漏斗下部装入烧瓶。5、试调加热器。将加热器调整旋钮逆时针调到底，接通电源，顺时针转动旋柄，逐渐加大电热器功率到适合程度（如果调小功率后，仍感到电热板温度过度，可在烧瓶与电热板间垫薄石棉网），然后关闭电源待用。