色谱系统适应性实验

肿瘤的发生是一个复杂的适应过程，涉及许多细胞功能的改变，包括细胞分化状态、端粒维持、细胞增殖控制、对营养状态改变的适应、血管生成能力的进化、细胞死亡的避免以及对蛋白质毒性和基因组胁迫的适应等等，这些改变被称为肿瘤的生长生存适应（Growth and survival adaptation，GSA）。在肿瘤发生过程中，肿瘤会通过破坏参与抗原处理和呈递的基因或上调抑制性免疫检查点基因来逃避免疫系统。目前已经通过多种方式鉴定发现了肿瘤中的驱动基因，但是这些肿瘤驱动基因是如何发挥作用的还不得而知。为了揭开这一问题的答案，美国霍华德休斯研究所Stephen J. Elledge研究组在Science发文，题为The adaptive immune system is a major driver of selection for tumor suppressor gene inactivation，揭开了肿瘤中肿瘤抑制因子的选择性失活所依赖的主要驱动因素是适应性免疫系统这一机制。肿瘤驱动基因的鉴定主要包括两种方式，其一是通过遗传和生化的方式分析病毒致癌基因或由病毒插入激活的基因【1,2】，其二是通过鉴定家族性癌症综合征以及其他零星发生的癌症鉴定反复出现的突变【3,4】，更为现代的技术对这些基因的分析会通过转座子、RNA干扰、CRISPR基因编辑技术、cDNA过表达以及高通量测序等检定这些基因潜在的肿瘤发生驱动能力。一直以来，肿瘤的生长生存适应基因的系统功能分析一直是癌症研究的焦点，但是目前的一些遗传筛选主要是在体外培养系统之中，这些二维的体外培养系统能够揭示与肿瘤细胞增殖和生存相关的一些基因，但是对于更为复杂的肿瘤微环境中不同细胞类型以及它们之间的相互作用是无法进行揭示的。除了与肿瘤生长和适应相关的基因促使肿瘤的发生和发展之外，肿瘤燎原之火想要进攻机体还需要克服另外一个障碍那就是免疫系统。肿瘤会想办法逃过免疫系统的威胁，造成免疫监视的适应（Immune surveillance adaptation，ISA）。为了对免疫调控基因进行检测，作者们构建了一个CRISPR文库，可以靶向7500个已知或者潜在的药物靶点基因。首先，作者们使用小鼠乳腺肿瘤模型进行文库转染，在选择细胞群体倍增后或者是皮下肿瘤移植到野生型或者是严重联合免疫缺陷型小鼠之中（图1）。通过该筛选，作者们筛到了一些生长调节相关的基因比如Pten，同时也鉴定发现了一些与抗原呈递以及免疫信号通路相关的因子比如B2m、Jak1等。除此之外，作者们还发现了一些熟悉的肿瘤抑制因子在适应性免疫系统存在的情况下出现富集，这引起了作者们的研究兴趣。图1 筛选免疫调控因子的工作流程图为了排除细胞种类特异性的效应，作者们又用相似的方式对结肠肿瘤细胞中进行了鉴定，随后作者们将目标集中在Gna13、Cul3以及Hdac2这三个因子之上，因为在CT26和4T1筛选中这些基因在野生型小鼠中观察到更强的表型以及它们在调节肿瘤细胞对适应性免疫系统的应答中可能存在一些未知的作用。进一步的，为了验证这些基因的作用，作者们对这些基因进行了敲除，这些基因敲除后对于肿瘤的体外增殖生长能力没有显著的影响，但是会在适应性免疫系统存在的情况下出现肿瘤的生长优势（图2），因此Gna13、Hdac2和Cul3会对适应性免疫系统存在的情况下特异性肿瘤抑制，该结果说明肿瘤细胞与免疫系统之间存在一定的相互作用。图2 Gna13基因敲除后只在适应性免疫系统存在的情况下出现肿瘤生长优势为了提高该结果对于药物靶点的指导性，作者们对一些人类肿瘤中已知突变的肿瘤抑制因子进行系统性CRISPR文库筛选。作者们对前500个预测的肿瘤抑制因子每个设计了10个sgRNAs，在三个不同的肿瘤细胞品系中进行转染，然后将肿瘤细胞移植到野生型或者适应免疫缺陷型小鼠中。当肿瘤长到目的大小时，作者们对其中的sgRNA丰度进行分析，筛选到的结果发现比如B2m或者Hdac2等肿瘤抑制因子会以一种适应性免疫系统特异性的方式促进肿瘤的生长。另外，作者们还鉴定发现了一个编码粘多糖降解相关的酶Gusb【5】，在转入Gusb的sgRNAs后只在野生型小鼠中出现阳性选择性生长，说明Gusb在调节肿瘤对适应性免疫系统中起着非常重要的作用。但是这肿瘤抑制因子是如何在适应性免疫系统特异性中的发挥作用的呢？GNA13的突变先前被报道发现发生在散发性癌症中，既可以作为癌基因又可以作为抑癌基因发挥功能，最常发生在淋巴瘤、子宫内膜肿瘤、膀胱肿瘤和肝癌中【6】。在适应性免疫系统存在的情况下，作者们发现GNA13可以作为肿瘤抑制因子发挥作用，但是具体的机制并不清楚。为此，作者们在结肠肿瘤细胞系中的构建了GNA13敲除品系，然后将这些细胞作为皮下肿瘤植入WT小鼠或在体外培养，并使用RNA-seq进行转录组分析。通过该分析，作者们发现GNA13的缺失会导致Ccl2表达的提高，进而导致CCL2分泌的增加。先前的研究表明CCL2是髓系细胞的招募因子。在敲低CCL2的情况下对肿瘤的生长并没有显著的影响，但是得在GNA13敲除的背景下敲低CCL2则会显著地削弱肿瘤的生长。另外，作者们发现过表达CCL2足以促进结肠癌肿瘤细胞的生长。因此，GNA13的肿瘤抑制功能是通过负调控CCL2的表达实现的。总的来说，该工作发现在肿瘤发生过程中，相对于严重联合免疫缺陷小鼠，适应性免疫系统中存在肿瘤抑制基因缺失的显著富集，并且这一机制是以癌症和组织特异性的方式实现的。该工作说明肿瘤中抑制因子的选择性失活所依赖的主要驱动因素是适应性免疫系统，为肿瘤的治疗以及肿瘤学的研究提供了新的见解。原文链接：https://science.org/doi/10.1126/science.abg5784

很少有人注意到，在一套色谱装置的内部有一个非常精致的色谱系统部件网络。我们希望能通过这篇文章，带大家了解中压和高压制备色谱的接头、管线和接口这三个部分，以及如何最好地安装和使用它们。 1色谱系统部件：接头常规的色谱接头看起来如下图所示：图示：色谱接头一览接头的设计可以是一体式的，即螺母和卡套结合在一起；也可以是两段式的，有单独的螺母和卡套，这两种设计都可用于中压制备色谱（Flash）的应用。一体式设计更容易使用，只需要用手拧紧。两段式设计提供了更多的选择和灵活性。当用钢材料制成时，它可以用扳手拧紧，而当用PEEK、FEP、ETFE或PTFE材料制成时，可以用手拧紧。图示:左侧为两段式接头，右侧为一体式接头关于构成色谱接头的材料主要有以下几类：钢 —— 是一种高强度的材料，对任何溶剂都有抵抗力。常见的钢制色谱接头一般都为316不锈钢，因此通常用于极度高压的应用，如高压制备色谱（Prep Hplc）。钢制接头只能使用一次，因为当它们被紧固在接口上时会发生不可逆的形变。PEEK —— 是一种高螺纹强度的材料，可抵抗大多数溶剂，但浓酸和氯化溶剂除外。这种材料高压适应性好，生物相容性强，非常适合需要频繁更换管线和连接件的应用，如中压和高压制备色谱（Flash和Prep HPLC）。FEP/ ETFE / PTFE —— 这种材料的螺纹强度较低，但对任何溶剂都有抵抗力，并且具有生物相容性，因此非常适合中压制备色谱（Flash）。常见的色谱接头主要由以下两部分组成：卡套—— 色谱接头的卡套可以是平底的，也可以是锥形的，如下图所示：图示：左侧的卡套为平底的，右侧的卡套为锥形的平底卡套适用于低压应用，如中压制备色谱。它们不是永久性地连接到管子上，而且卡套的尖端面向螺母。锥形卡套更适合于高压应用，如高压制备色谱。这些类型的卡套一旦被紧固就会变形并固定在管子上，卡套的尖端远离螺母。螺母—— 螺母的尺寸可以用英制来描述，比如直径≥1/4"，孔径为≤1/4"，有若干螺纹。或者也可以通过公制尺寸来描述，比如直径为6毫米，螺纹间距为1毫米。更大的直径（1/4-28）用于高流速的系统（Flash），以减少背压。更多的螺纹（10 -32）可以抵抗更高的压力，是高压系统的首选，如Prep HPLC。螺母头可以是滚花头（Knurl），需要用手指拧紧，也可以是六角头（Hex），通常只由钢制成，需要用扳手拧紧。图示：左侧为滚花头，右侧为六角头2色谱系统部件：管线管线的材料同样有很多种，包括不锈钢，PEEK，PTFE 以 及ETFE 等等。这些管线的内径（ID）和长度会影响背压和死体积，从而影响峰形。常见的内径为 0.08"，用于中压制备色谱（Flash），0.02" 用于高压制备色谱。常见的外径有用于中压制备色谱的1/8"和用于高压制备色谱的 1/16"。由于管线的长度越长，所产生的背压和死体积就越大，因此需要根据管线所连接的部件决定其长度。3色谱系统部件：接口接口可用于不同尺寸的螺母。例如，10 - 32 用于锥形螺母，1/4-28 用于平底螺母。接口可以是平底的，用于契合卡套的平底。这些类型的接口适用于中压制备色谱。接口也可以是锥形的，用于契合卡套的尖端。锥形端口适用于高压制备色谱。图示：左侧为平底接口，右侧为锥形接口在使用以上这三个色谱系统部件时，我们还需要注意这些事项才能保证最佳的使用状态：在安装到任何色谱系统之前，确保所有的管线都有一个笔直的切口，边缘没有任何残留物始终使用适当的工具来切割管线滚花头的螺母或配件只能用手拧紧过度拧紧螺母或接头通常会减少管线的内径，导致压力升高和流速错误六角接头通常与不锈钢管一起使用，首次安装时必须用手拧紧，以免损坏螺纹。用手拧紧后必须用合适的扳手再次紧固（通常为1/4圈）低复杂度样品纯化左右滑动色块查看系统适合的应用范围↓对于低复杂度样品，可以轻松或妥善地分离感兴趣的峰与杂质。使用中至大粒径 (15 - 60 μm) 颗粒是标准应用最经济的解决方案高复杂度样品纯化左右滑动色块查看系统适合的应用范围↓高复杂度样品难以分离并显示出部分重叠的峰需要使用小粒径 (5 - 15 μm) 硅胶颗粒以提供出色的分离度 (=纯度)，但会产生高背压从低到高样品浓度的进样左右滑动色块查看系统适合的应用范围↓可支持上样量最大 300g可支持 Flash 预填充色谱柱尺寸：最大 5000g可支持耐高压玻璃柱尺寸：直径 46-100mm支持固体上样和液体上样两种方式低样品浓度进样左右滑动色块查看系统适合的应用范围↓可支持上样量最大 1g可支持高压色谱柱直径尺寸：4.6-70mm支持液体进样检测生色团化合物左右滑动色块查看系统适合的应用范围↓生色团化合物吸收紫外波段或可见光波段 (200 - 800 nm) 的光线适用于紫外线检测的化合物通常含有不饱和键、芳族基或含杂原子的官能团。检测非生色团化合物左右滑动色块查看系统适合的应用范围↓非生色团化合物不吸收光，因此不能通过紫外线检测器显现典型化合物为碳水化合物非生色团化合物可通过蒸发光散射 (ELS) 检测装置来检测

2023年4月14日，国家重点研发计划项目“高适应性现场监测有害物实时原位确证检技术研发” 课题5 -“动物源性产品中有害物全链条高适应性检测技术体系研发及应用示范”启动会暨实施方案论证会，以线上线下联合的形式在谱育科技高端科学仪器产业化创新基地正式召开。 专家组及课题组成员 中国检验检疫科学研究院 张峰副院长、华南农业大学 雷红涛教授、宁波大学 燕飞副所长、浙江大学 吴坚教授、中国农业大学 林建涵教授组成了专家组；中国计量大学、深圳市计量质量检测研究院、杭州谱育科技发展有限公司的课题、任务负责人及技术骨干参加本次会议。 课题开发意义课题旨在针对动物源性产品在生产、仓储、物流、交易、消费等场景下有害物检测速度慢、稳定性差、准确性不足的问题，基于研发的针对不同场景下的检测装置和技术，考察、评价并优化检测技术，构建全链条动物源性产品有害物高适应性原位、实时、无损检测技术体系并示范推广。谱育科技主要承担课题中方法开发和创新应用任务。课题方案通过评审华南农业大学 雷红涛教授主持作为评审专家组长并主持本次会议；中国计量大学 俞晓平副校长对与会专家领导表达了欢迎致辞；中国计量大学生命科学学院副院长 申屠旭萍教授对课题研究内容、技术路线、任务分解等作了总体汇报；各任务负责人分别对研究任务和实施方案进行了详细汇报。中国检验检疫科学研究院 张峰副院长对课题组汇报内容给予了肯定，并从课题定位、目标定位、行业应用等方面提出了建议。 专家组通过讨论形成评估意见，一致认为课题论证材料完备，目标明确，实施方案和技术路线可行，任务清晰合理，符合课题任务书要求，预期成果与考核指标基本明确，同意通过此课题的实施方案评审。 参观谱育科技 高端科学仪器创新基地与会专家参观考察了谱育科技高端科学仪器产业化创新基地，详细了解了谱育科技以ICP-MS、ICP-MS/MS、LC-MS/MS、GC-MS 、GC-MS/MS等质谱仪器为核心的高端科学仪器国产化进程与产业化创新应用，以及以客户为基准的定制与创新开发能力，肯定了谱育科技研发及产业化创新实力。 打好科技仪器设备国产化攻坚战以高质量发展推进中国式现代化谱育科技专注于重大科学仪器研发和产业化创新应用，承担了国家发改委技术攻关专项、国家重点研发计划、国家重大科学仪器设备开发专项等国家重大项目十余项，积累了二十余项新型技术平台，率先实现了液相色谱-三重四极杆质谱联用仪、电感耦合等离子体质谱仪、气相色谱离子阱质谱联用仪等系列产品的产业化。