合成测序细胞分析

p　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "什么叫做单细胞基因测序(Single-Cell Sequencing)?/span/pp　　一句话说，就是单个细胞水平上对基因组进行测序。2013年，自然杂志把年度技术授予了单细胞a title="" href="http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-3-1-1.html" target="_self"span style="color: rgb(255, 0, 0) "基因测序/span/a(Single Cell Sequencing)，认为该技术将改变a title="" href="http://www.instrument.com.cn/application/SampleFilter-S01-T000-3-1-1.html" target="_self"span style="color: rgb(255, 0, 0) "生物界和医学界/span/a的许多领域。/pp　　span style="color: rgb(0, 112, 192) "我们为什么要进行单细胞基因测序?/span/pp　　传统的测序方法，无论是基因芯片或者二代基因测序技术(Next Generation Sequencing，NGS)都需要从超过10万个细胞中提取一大堆(bulk)DNA或者RNA，而提供的信息是一大堆细胞的平均值。但是传统的方法，对于理解人体细胞的多样性有着明显的局限性。/pp　　在人体的每一个组织中，比如说，肾脏组织，拥有着大量不同的细胞类型，每一种细胞类型有着独特的起源和功能。每一个细胞的谱系和发展的状态又决定了每个细胞如何和周围的细胞和环境如何反应，把基因测序应用到单个细胞层面，对于我们理解细胞的起源，功能，变异等有着至关重要的作用。/pp　　关于二代基因测序已经详细在我们的前期两篇深度报告中进行了介绍，在本篇报告中，我们将详细解读单细胞基因测序，以及该技术对癌症，辅助生殖以及免疫学等领域带来的新的突破。/pp　　strong一、单细胞基因测序行业：刚启程，面临引爆点/strong/pp　　BCC Research的一项分析报告指出，2014年全球单细胞分析(Single-cell Analysis)的市场达5.4亿美金，预测将从2015年的6.3亿美金增长到2020年的16亿美金，复合增长率达21%。根据GENReports的报告，关于单细胞分析的文章发表在过去的几年也有着爆发性的增长。/pp style="text-align: center "　　图2：单细胞分析的文章发表数量/pp style="text-align: center "img title="1.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/006c9fd7-a2cd-46b2-a028-18b51b5ea3cd.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：GEN，民生证券研究院/pp　　其中，传统的单细胞基因组学主要是由基因芯片和PCR主导的，随着二代基因测序的成本以超摩尔定律下降，目前单细胞基因组学逐渐由二代基因测序技术接棒。/pp　　和qPCR在90年代的发展一样，目前所有的刺激因素(高度的科研兴趣，生物医药巨头公司的关注等)正在解锁这个市场，单细胞基因测序行业正面临引爆点。/pp　strong　二、单细胞基因测序的基本流程：单细胞分离--基因组扩增--测序和分析/strong/pp　　单细胞测序，简单地说，主要经过如下的步骤：单细胞的分离--DNA/RNA的提取和扩增(全基因组扩增和全转录组扩增)---测序以及后续的分析和应用。/pp style="text-align: center "　　图3：单细胞测序的步骤/pp style="text-align: center "img title="2.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/782ee757-3c06-4a1b-9103-4c7336ac2929.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Recent advances and current issues in single-cell/pp style="text-align: center "sequencing of tumors，民生证券研究院/pp　　2.1 单细胞的捕捉和分离/pp　　单细胞测序的第一步是单细胞的分离和提取，目前的方法主要有如下几种方法：流式细胞术，激光捕获显微切割技术以及微流控技术。/pp style="text-align: center "　　图4：单细胞分离的三种方式：流式细胞术，激光捕获显微切割以及微流控技术/pp style="text-align: center "img title="3.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/ea66e087-c9b2-4930-a4d3-50025543fe8b.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Technologies for Single-Cell Isolation，民生证券研究院/pp　　1)流式细胞术 (Flow Cytometry)/pp　　是指通过对于悬浮于流体中的细胞或者其他颗粒进行定量分析和分选的技术。在各种流式细胞仪中，大家主要讨论的是荧光活化细胞分类计FACS(Fluorescence Activated Cell Sorting)系统分离单细胞。定量原理：待测细胞经特异性荧光染料染色后，加入样品管中，经过测量区，由染色后的细胞在激光照射下的荧光产生的电信号来进行定量分析 分选原理：通过流束形成含有细胞的带电液滴来实现的。/pp　　2)激光捕获显微切割技术Laser Capture Microdissection(LCM)/pp　　LCM技术可以在显微镜直视下快速、准确获取所需的单一细胞亚群，甚至单个细胞，从而成功解决了组织中细胞异质性问题。其基本原理是通过一低能红外激光脉冲激活热塑模-乙烯乙酸乙烯酯(EVA)膜，在直视下选择性地将目标细胞或组织碎片粘到该膜上。/pp　　3)微流控技术(Microfluidics)/pp　　微流控技术是一种用于精确控制微量液体的技术。微流控芯片是实施该技术的平台，通常通过细微的管道对液体实施操控，微流控对液体的操控尺度, 刚好适合于单细胞样品的处理操作。/pp　　2.2 全基因组扩增 (Whole Genome Amplification. WGA)/ 全转录组扩增 (Whole Transcriptome Amplification，WTA)：单细胞测序的难点/pp　　2.2.1 主要的三种全基因组扩增技术，各有优势/pp　　由于在单细胞中的DNA和RNA的数量非常小(几个pg)，用传统的测序仪无法检测，所以科学家们必须首先对这些分子进行扩增，同时尽量的减少错误。目前的全基因组扩增技术主要有三种：简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)，多重置换扩增(MDA) 和基于多次退火和成环的扩增循环(MALBAC)。/pp　　1)基于PCR技术的全基因组扩增技术，例如DOP-PCR(简并寡核苷酸引物PCR扩增)/pp　　DOP-PCR是一种部分随机引物法, 其引物构成为3& #8242 -ATGTGG-NNNNNN-CCGACTCGAG-5& #8242 ；主要 利用3& #8242 端ATGTGG这6个在人体中分布频率极高的碱基作为引导, 以6个碱基的随机序列来决定特异的扩增起始位点，从而达到扩增整个基因组的目的。/pp　　2)多重置换扩增(MDA)/pp　　MDA是一种等温的链置换扩增反应, 其使用随机的6碱基引物在多位点和模板链结合, 接着利用 phi29DNA 聚合酶很强的模板结合和置换能力实现对全基因组的扩增。/pp style="text-align: center "　　图5：DOP-PCR和MDA全基因组扩增技术简介/pp style="text-align: center "img title="4.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/d9b0aef0-e3b1-4c63-8313-c20796064bb3.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Single-cell genome sequencing: current state/pp style="text-align: center "of the science，民生证券研究院/pp　　3)MALBAC(Multiple annealing and looping-based amplification cycles)基于多次退火和成环的扩增循环/pp　　通过采用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而达到近乎线性的扩增,该技术是哈佛大学谢晓亮教授团队发明的。/pp style="text-align: center "　　图6：MALBAC全基因组扩增的示意图/pp style="text-align: center "img title="5.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/83e2f828-d990-4b9c-afd6-bd692fc52888.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Single-cell sequencing by Doug Brutlag，民生证券研究院/pp　　表1：三种类型的全基因组扩增方式比较/pp style="text-align: center "img width="600" height="302" title="QQ截图20160302115018.jpg" style="width: 600px height: 302px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/297e4e6e-a134-4101-a297-456cd703c3af.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Single-Cell Sequencing Technologies: Current and Future，/pp style="text-align: center "民生证券研究院/pp　　Navin 在研究报告中指出(来源：Cancer genomics: one cell at a time)，对于检测CNV(Copy Number Variation)的时候，DOP-PCR以及MALBAC较有优势，另一方面， MDA方法一般用来检测点突变。Gawad et al., (2015)更是指出，三种全基因组扩增技术并没有明显的胜者，具体方法的使用取决于研究的目的。/pp　　2.2.2 全转录组扩增/pp　　一个哺乳动物的单细胞大约含有10pg的RNA，其中mRNA大约在0.1-0.5pg，并不能满足目前测序平台的要求，所以需要进行全转录组扩增技术。/pp　　单细胞中提取的RNA首先经过逆转录出cDNA，然后对逆转录生成的cDNA进行扩增。目前主要的转录组扩增技术主要包括如下几种：传统的PCR，改进的PCR，T7-in vitro 体外转录组扩增以及Phi29聚合酶扩增。/pp　　三. 单细胞测序的主要应用：癌症，辅助生殖以及免疫学领域/pp　　当单细胞被分离，细胞内的DNA/RNA被提取和扩增后，二代基因测序(Next Generation Sequencing)可以用来进行后续的测序。当把基因测序应用于单个细胞层面，在下游应用领域有着先天独到的优势。/pp　　3.1单细胞基因测序技术有助研究癌症起因和治疗/pp　　首先谈一下癌症的异质性：中晚期的肿瘤或由一系列的肿瘤克隆组成，每一种克隆有着独立的变异，形态和药物反应。对于肿瘤克隆精准的诊断非常重要，因为一个占据原发性肿瘤5.1%的亚克隆种群在复发的时候可能成为主要的致病因素。/pp style="text-align: center "　　图7：肿瘤的异质性/pp style="text-align: center "img title="6.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/88b49609-3a47-4577-ad2a-7e9b36b6a4dc.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Illumina，民生证券研究院/pp　　实体瘤由一系列不同的细胞组成，包括癌症纤维细胞，内皮细胞，淋巴细胞，巨噬细胞等。同时，实体瘤由多个肿瘤克隆亚种群构成，使得临床样本的分析更加复杂。当多个肿瘤克隆同时存在时，标准方法检测的要么是平均信号要么是主要的克隆群体(并不一定是最致病的)的信号。/pp　　而同时，肿瘤的异质性和癌症产生抗药性以及转移密切相关，所以，单细胞测序开始用来检测肿瘤内基因异质性，对于癌症起因以及后续治疗的研究非常关键和重要。/pp　　例如，Navin et al.(2011), 利用单细胞基因测序的方法(流式细胞术提取细胞-全基因组扩增-NGS)，在某个乳腺癌肿瘤组织中检测了100个乳腺癌细胞的CNVs，覆盖度大约6%，发现了三种完全不一样的克隆亚种群。/pp　　除了肿瘤细胞，单细胞基因测序同样可以应用于循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells)和外周血播散肿瘤细胞DTC(disseminated tumor cells)，该部分内容将在后续的研究报告中深入讨论。/pp　　3.2 单细胞基因测序助力辅助生殖/pp　　PGS(Pre-implantation Genetic Screening)是胚胎注入前遗传学筛查，主要是通过检测胚胎的23对染色体结构、数目，来分析胚胎是否有遗传物质异常 PGD(Pre-implantation Genetic Diagnosis)，主要用于检测胚胎是否携带遗传缺陷的基因，关于PGS/PGD的介绍，请参考我们之前的行业深度《基因+大数据的颠覆：从癌症基因测序到辅助生殖》。/pp　　PGD过程中，目前主要有三种方式获得活检材料：1)卵子的第一极体和第二极体 2)培养至第3天胚胎卵裂期的卵裂球细胞(一般取1-2个细胞) 3)培养第5天左右的囊胚细胞。/pp　　例如，牛津大学的Dr.Dagan Wells团队，通过对囊胚细胞进行单细胞基因测序，选择健康的胚胎植入。另外，谢晓亮教授团队通过对女方卵细胞极体细胞进行测序，结合胚胎选择，选择正常的胚胎移植。/pp style="text-align: center "　　图8：卵母细胞减数分裂产生极体的过程/pp style="text-align: center "img title="7.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/a1c2724b-0f2c-4b27-9eca-d304dccd613c.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Genome Analyses of Single Human Oocytes，民生证券研究院/pp style="text-align: center "　　(注：其中PB1和PB2是第一极体和第二极体)/pp　　3.3 单细胞基因测序打开免疫报多样性研究之门/pp　　用单细胞基因测序分析免疫细胞的原因是现存的多样的病原体导致了免疫细胞的高度异质性，传统的检测方法，取样来自一大堆细胞，低估了单个免疫细胞的多样性，所以我们需要更加精确检测单个免疫细胞的遗传物质，从而理解机体复杂的免疫机制。正如开篇提到的Juno收购的单细胞基因测序公司AbVitro致力于T细胞和B细胞的基因测序。/pp　　图9展示了对单个T细胞受体基因测序(TCR Sequencing)的流程。TCR & #945 和& #946 mRNA经过逆转录，扩增，重叠延伸，目的基因被选择性地进行PCR扩增以及后续的分析。/pp style="text-align: center "　　图9：TCR Sequencing过程/pp style="text-align: center "img title="8.png" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/04e7c357-80bd-4709-89dc-92ee07a28fa9.jpg"//pp style="text-align: center "　　资料来源：Pairing of T-cell receptor chains via emulsion PCR，/pp style="text-align: center "Illumina，民生证券研究院/pp　　四. 单细胞基因测序未来的发展之路/pp　　在目前来看，单细胞基因测序还处在非常初级的阶段，也面临很多技术的挑战，包括：如何高效的分离细胞，全基因组无偏差的扩增，以及下游的数据分析等。但各大生物医药巨头都已经目光锁定了这个方向，除了今年初Juno收购AbVitro(单个T细胞和B细胞进行基因测序)，去年八月BD公司收购了单细胞测序公司Cellular Research。Illumina也通过和Clontech合作，推出了单细胞RNA测序服务。/pp　　我们认为，未来的基因测序一定朝着更精准，更微观的方向前进，如今，单细胞测序正面临着一场革命，在单个细胞层面让我们在前所未有的水平理解基因组学，表观基因组学和转录组学的多样性。/pp　　背景案例：/pp　　2016年1月，肿瘤免疫疗法的领头羊公司Juno宣布以1.25亿美金的股票和现金收购波士顿的一家单细胞测序公司：AbVitro Inc.。 AbVitro公司的技术起源于哈佛大学George Church的实验室，AbVitro的技术包括对单个T细胞和B细胞进行基因测序，帮助科学家们理解T细胞受体(T cell receptor & #945 和& #946 链的基因的复杂性。/pp　　图：Juno收购AbVitro之后的布局/pp style="text-align: center "img title="9.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201603/noimg/6ef1eca1-dc46-4600-9c6d-d95f77a85f9e.jpg"//p

最近，来自美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校、克雷格· 文特尔研究院和Illumina公司的科学家对现代基因测序算法进行了改良，只需从一个细菌细胞中提取的DNA(脱氧核糖核酸)就可组装成接近完整的基因组，准确率达到90%，而传统的测序方法至少需要10亿个相同的细胞才能完成。这一突破为那些无法培养的细菌提供了测序方法。研究发表在9月18日的《自然· 生物技术》网络版上。　　实验室无法培养的细菌范围极广，约占99.9%，从产生抗体和生物燃料的微生物，到人体内的寄生菌。它们的生存条件特殊，比如必须和其他菌种共生，或只能生存在动物皮肤上，因此很难进行人工培养。　　论文合著者、文特尔研究院的罗杰· 拉斯肯教授10年前曾开发出一种多重置换扩增(MDA)技术，可对实验室无法培养的细菌测序，能恢复70%的基因。其工作原理是对一个细胞的基因片断多次复制，直到其数量相当于10亿个细胞那么多。不过，这种技术却给测序软件带来很多麻烦，它在复制DNA时会出现各种错误，而且并非完全统一放大，有些基因组被复制数千次，有一些却只被复制一两次。但测序算法不能处理这些不一致，而是倾向于舍弃那些只复制了少数次的基因，即使它们对整个基因组来说很关键。　　加州大学圣地亚哥分校雅各布工程学院计算机科学教授、现代基因测序技术算法创建人帕维尔· 帕夫纳和同事改进了这一方法，保留了那些少量复制的基因片断，并用新方法对一个大肠杆菌测序以检验其精确性，发现它能恢复91%的基因，接近传统的培养细胞水平。这已足够解答许多重要的生物学问题，比如该细菌能产生什么抗体。　　人体细菌占体重的约10%，它们有些会造成传染病，但也有的能帮助消化，最近研究还发现，它们能改变人的行为方式，比如引诱人吃更多的东西。新方法也有助于科学家理解细菌行为，研究人体内细菌能产生哪种蛋白质和多肽，这些蛋白质和多肽是细菌之间、细菌和宿主之间互相沟通的工具。　　研究小组还用新方法对一种以前未曾测序过的海洋细菌进行了测序，获得了相当完整而且能解释的基因组，掌握了它是如何生存和运动的，该基因组将被存入美国国家卫生研究院的基因银行(GenBank)。研究人员表示还将对更多迄今未知的细菌进行测序。

单细胞测序：少量细胞和稀有细胞的解决方案做单细胞测序的时，您是否遇到下列情况： ü 细胞样本量较少，不够做一次高通量单细胞测序… … ü 没有简便易用的设备分选单个细胞… … ü 保护细胞的基因完整性难度大… … ü 分选到单细胞后，找不到合适的试剂进行下一步操作… … 如果这些问题曾给您带来困扰，4月28日由Namocell联合Qiagen带来的关于“少量细胞和稀有细胞的单细胞测序解决方案”的讲座，一定会让您有所收获。 近年来的单细胞研究表明，生物体由数千种独特且不可重复的细胞类型组成。由于单细胞中核酸数量有限，使用二代测序（NGS）方法进行单细胞分析（类似于低样本量测序）传统上具有挑战性。当研究群体较小时，这种限制变得更加明显，例如稀有细胞样本（阳性细胞占比0.1%以下）。高保真度（HiFi）和高质量的DNA扩增对于单细胞测序至关重要，这在很大程度上取决于分离细胞的质量。因此，用于分离单个细胞的方法对于确保细胞活力和核酸完整性至关重要。 美国Namocell公司专利的轻柔分选和细胞富集技术为您克服上述挑战，为单细胞测序提供了更高数量和质量的细胞样本，让您能够轻松获得细胞样品的完整且准确的遗传信息。 无论您是单细胞分析的初学者还是专家，相信都能在这个信息丰富的网络研讨会中有所收获。让我们一起了解和探讨少量样本和稀有单细胞测序的重要因素和新技术。 会议时间2022.4.28 16:00-17:00（注册时选择观看时间为Thursday, April 28, 2022, 10:00 AM CEST） 报名通道（点击） 主讲人介绍