单细胞膜片钳系统

膜片钳实验系统配置 一个电生理配置有4个主要的需求：环境需求：保持标本的健康的手段。光学需求：显现标本以供观察的手段。机械结构需求：稳定定位微电极的手段。电子学需求：放大和测量信号的手段。我们将配置分成两种类型的“典型”配置：胞外记录和单通道膜片钳记录。胞外记录的配置 该配置主要用于记录脑片的场电位。一般目标是将一个相对粗糙的电极放置在组织的胞外空间，同时尽可能模仿体内的组织环境。因此，需要一个相当复杂的小空腔，用来对组织进行温暖、氧化、灌注。而另一方面，光学和机械结构需求则简单得多。一个显微镜，至少15cm的工作距离(配合近似垂直放置的微操纵器)，通常已经可以看到切片或大体的形态学特征。由于对定位时手的震动和电极的精确放置都没有苛刻要求，微操纵器可以选用相对粗糙的机械类型。但是，在记录过程中，微操纵器不允许有一点漂移和震动。 需要使用低噪声的电压放大器。由于信号的范围可能在10 uV 到10 mV 范围内，低噪声电压放大器的增益至少要达到1000。单通道膜片钳记录配置 标准的膜片钳配置在许多方面与胞外记录恰好颠倒过来了。由于对环境的控制非常少，实验通常在室温下、一个无灌注的培养皿中进行。 光学和机械需求则根据实际的细胞的大小(10或20 um)有特殊的规定。显微镜应该有放大300或400倍的能力，并需要某种对照增强能力(Nomarski, Phase or Hoffman)。Nomarski(微分干涉)对于电极的精确放置是最好的，因为它的影像依赖于视野一个很窄的深度上，这有助于精确定位(定位不好，影像是模糊的)。Phase(相差法)用于精确定位程度要求低一些的场合，但提供了更好的对比度。Hoffman方法提供了较便宜的，稍微退化点的Nomarski版本。最好使用倒置显微镜(如奥林巴斯的倒置研究级显微镜IX71/IX81)：(1) 这样能使电极顶端更容易被看到，因为物镜在chamber的下方，(2) 提供了更大更坚固的平台，用来固定微操纵器。 微操纵器应提供良好的，平滑的移动(最多每秒2um)。对震动和稳定性的需求决定于记录模式：是希望记录cell-attached- patch，还是cell-free (inside-out or outside-out) patch。 在cell-free- patch中，微操纵器只需要在形成封接过程中保持稳定，一旦离开了细胞，稳定就不是那么至关重要了。这通常不到一分钟。 单通道记录的放大器比胞外记录使用的要复杂得多。组织切片膜片钳记录配置 膜片钳技术的近来扩展，切片膜片钳技术，其配置需要是体外胞外记录和常规膜片钳配置的一个组合。例如，该技术可能需要一个chamber，需要连续对切片进行灌流和供氧。大部分的其他要求，与常规膜片钳类似。光学需求与切片的厚度有关(thick-slice or thin-slice)，对thick-slice，简单的解剖显微镜就够了(如奥林巴斯的解剖SZ和SZX系列显微镜)；而对thin-slice，显微镜则需要提供400倍的放大，良好的顶端聚焦和对照增强。设备放置 电生理实验人员倾向于在小房间的一角独自工作。小房间通常比较安静，震动和空气流动被削减了。 首先放置显微镜是比较明智的，然后是密切联系的附件，例如chamber，微操纵器和温度控制系统(如果安装了)。基本原则是第一要保证细胞恰当的处于静止状态，第二要确认从细胞记录信息的行为没有对细胞带来连续的致命伤害。第一原则可以通过良好的实验环境帮助实现，第二原则通过良好的光学和机械手段实现。 在显微镜周围工作，保持例如灌注阀门和微操纵器的控制要非常谨慎，避免震动。理想的情况是，它们放置在一个小架子上，该架子从防震台延伸出来，保证在通过显微镜观察细胞时，不会产生破坏的震动。 选择和放置电子仪器是个人偏好的事情。最低的要求是只有一个放大器和一台计算机，另外强调最好放置在一个仪器架上。一个示波器是重要的，因为，计算机通常不够灵活；而且，示波器常能展现在计算机屏幕上看不到的一些意外情况，例如计算机的采样率设置不合适时，就会丢失大量细节信息，而示波器则不会。 示波器应与眼睛水平，在示波器上面或下面直接放置微电极放大器，以便容易的调整和监视信号。 计算机应放置得尽可能远，但离显微镜还是应该保持在手臂来回够得着的地方。这有助于削减显示器的辐射噪声，也能确保在使用键盘匆忙记录时不至于肘部撞击显微镜。 膜片钎实验的平台---显微镜: 完成膜片钳实验最关键的前提是要有一台性能优异的显微镜为基础平台,只有在这个基础平台上才能完成膜片钳这一高技术含量的实验,例如奥林巴斯为膜片钳实验就提供了这个很好的平台,如BX51WI/BX61WI是专门为脑片膜片钳实验所提供的显微镜平台,而IX71/IX81则为单细胞膜片钎实验打下了坚实的实验基础.[em61] [em43]

【序号】：1【作者】：马宏1邢飞1项舟【题名】：干细胞膜片在骨与软骨修复中的应用【期刊】：华西医学. 【年、卷、期、起止页码】：2023,38(10)【全文链接】：https://kns.cnki.net/kcms2/article/abstract?v=Eo9-C_M6tLk9uZm4IkSK1syfkr0KDbFTcR0617hZuaOO2RfuHSxVbqaoIynt7ZcTvLJt5-3SIRpa86mQX1e7IjPPmI8GtcsVZ8ywUEJunoyVxXNl-EZ7vjp8_-Gb8KPo9lovkvfL5A4=&uniplatform=NZKPT&language=CHS

[b]活体研究智能传感技术的演进（3）现状与未来作者：许越 [url=https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzA3OTE0NTI3OQ==&mid=2651820382&idx=2&sn=b59711014ab3bac4117cfe0f115a62da&chksm=844cc10eb33b48181a6e3cd18f734ae66f9059d781d54320e045b89677bd8bb7943c8bb0df6c&scene=21#wechat_redirect]点击查看作者自传[/url][b][color=#a5a5a5]许越，男，1967年生于北京。[/color][/b][/b][list][*][color=#a5a5a5][color=#888888]于[/color][color=#888888]1993[/color][color=#888888]年和[/color][color=#888888]2000[/color][color=#888888]年分别获得首都师范大学及美国麻省州立大学，植物生理学双硕士学位。[/color][/color][*][color=#a5a5a5][color=#888888]2001[/color][color=#888888]年在美国创建基于[/color][color=#888888]NMT[/color][color=#888888]技术的美国扬格公司，次年运用[/color][color=#888888]NMT[/color][color=#888888]服务于设立在美国北卡州立大学的美国航空航天局[/color]([color=#888888]NASA[/color])[color=#888888]空间植物学研究项目。[/color][/color][*][color=#a5a5a5][color=#888888]2005[/color][color=#888888]年成立旭月（北京）科技有限公司，在匡廷云院士、杨福愉院士和林克椿教授的帮助，以及各级政府的大力支持下，将非损伤微测技术引进中国大陆。[/color][/color][*][color=#a5a5a5][color=#888888]2014[/color][color=#888888]年带领旭月团队提出被誉为“第二个人类基因组计划”的“动态分离子组学（[/color][color=#888888]imOmics[/color][color=#888888]）”创新概念，同年成立旭月生物功能研究院。[/color][/color][*][color=#a5a5a5][color=#888888]2015[/color][color=#888888]年推出世界领先的“自动化非损伤微测系统”，并倡导建立中关村[/color][color=#888888]NMT[/color][color=#888888]产业联盟，开启以水安全、个体化精准医疗、粮食安全等民生应用为代表的[/color][color=#888888]NMT[/color][color=#888888]产业化进程。[/color][/color][*][color=#a5a5a5][color=#888888][color=#a5a5a5]截至2016年，已帮助国内400多个科研单位及实验室，利用NMT实现了科研水平的跨越式发展。[/color][/color][/color][/list]PC膜片钳与NMT非损伤微测技术虽然几乎诞生在同一历史时期，但是它们的发展和普及过程却大相径庭。[b]1） NMT的中国特色[/b]大家知道，各个国家对动物医学研究的投入通常要远远高于对其它研究领域的投入。下图是美国在医疗健康上面的投入是其它领域的5-10倍，在中国动物医学方面的投入大概是植物学研究的6倍左右（来自于个人通讯）。[align=center][img]https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_jpg/iaFShJzBuGDEbuf6P7NZBiavESu2yf2ug2MvS7dCXdDYBfqrNMk6gpicChvuLDRS1569mM4NaA54xUEhEbZYcSY3w/640?wx_fmt=jpeg&wxfrom=5&wx_lazy=1[/img][/align][align=center]（来自于网络）[/align]因此，在绝大多数情况下，很多生命科学的新技术，新思路，新突破，都是来自于动物医学领域，然后传导到其它科研领域，正如在本文的第一部分[url=https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzA3OTE0NTI3OQ==&mid=2651820348&idx=1&sn=bd4fb10beab21b0499c233c9c6df16d5&chksm=844cc16cb33b487ae3226d4e2a4782738fe7a4203ab8a52d838ec30831ba79bf9f5d77cd0e81&scene=21#wechat_redirect]（1）愿望与挑战[/url]中所叙述的那样，膜片钳技术诞生于动物神经细胞单通道离子电流（烟碱乙酰胆碱受体）的研究，90年代进入中国后，也被首先应用于动物医学研究。然而，非损伤微测技术在生命研究领域的发展，却划出了一个自己较为独特的发展轨迹。首先，大家去问问用膜片钳搞植物研究的科研人员，他们有多么羡慕用膜片钳进行动物医学研究的同行们，因为植物有细胞壁，研究植物的人必须要先用各种消化酶去除细胞壁后，才可以形成膜片钳技术必须的玻璃电极与细胞膜之间的高阻封接。[align=left]那么，大家可以想象，不用去除细胞壁就可以研究植物与外界环境的离子/分子交换信息，这对于搞植物研究的人该有多么大的吸引力呀！姑且不说，细胞壁作为植物细胞完整结构的一部分，在功能上更是不可或缺的重要环节，将其人为去除后，其结果的理论价值必然大打折扣外，单就技术上给植物学家们带来的简单、便捷和快速，就让大家兴奋不已。[/align] [img]https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_jpg/iaFShJzBuGDEbuf6P7NZBiavESu2yf2ug27IT7uZGkSnBKveX2hqCR3kByLLiaCiciaGpamSXicEKMicmibyic9tTbVLPlg/640?wx_fmt=jpeg&wxfrom=5&wx_lazy=1[/img][align=center][img]data:image/gif base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAAEAAAABCAYAAAAfFcSJAAAADUlEQVQImWNgYGBgAAAABQABh6FO1AAAAABJRU5ErkJggg==[/img][/align][align=center]（种康在《Cell》利用NMT发表水稻植物领域文章）[/align]因此，在国际上自从NMT诞生之日起，植物研究学者们对它的追求从来没有逊色于动物医学研究的同行们。而中国自身为农业国，在植物领域的研究底子好，投入又大。可能也加之旭月公司创始人自身的植物研究出身的背景，使得非损伤微测技术在中国的发展一路走来，在植物领域的发展要远远胜于在动物医学的发展，数据显示，在中国科学家至今发表的200多篇NMT应用已发表文献里，80%以上是来自植物领域的研究（数据来自“中关村NMT产业联盟”http：//nmtia.org）。[b]2） 科研应用现状[/b]膜片钳技术在这二十几年的发展使其已经深深地融入了全世界生命科研活动的各个方面。在中国也不例外，这些年我国科研人员利用该技术取得了丰硕的科研成果，尤其是植物研究领域，以武维华、种康、刘春明等为代表的科研人员利用膜片钳技术在植物生理生化方面取得了系列世界级的成果。我国的动物医学研究方面，以周专、徐涛、王世强、王立伟、陈丽新、祁金顺等科学家为代表在诸多领域也已处于世界科技前沿。但就我个人在国外多年的所见所闻来看，我国在动物医学方面没有比现在发展的更快更好一些的一个重要原因是中国这方面的人才流失比较严重。我在哈佛、耶鲁等大学见到很多国内培养的膜片钳高手。即：国内培养出来后，在就要出成果的时候，却来到国外为国外的课题所用了。想必周专老师他们对这点肯定有更深更多的感受吧。非损伤微测技术在中国的普及应用，相比膜片钳技术有两个先天不足。一是进入中国要晚近10年的时间；二是没有膜片钳那样一开始便伴随着诺贝尔奖的耀眼光环。但是，非损伤微测技术也有其自身的优势，其一是进入中国适逢国家对基础科研的投入要远远大于90年代膜片钳进入时期；二是有匡廷云、杨福愉、林克椿、叶鑫生、高荣孚、尹伟伦、赵微平、邱泽生等老一辈科学家的鼎力支持。[align=center][img]https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_jpg/iaFShJzBuGDEbuf6P7NZBiavESu2yf2ug2wjQ6aFhplNcl23wiarAqicxyxVibbOMIfrP4Y6ftiaDAchOn8awoaOJ9Tg/640?wx_fmt=jpeg&wxfrom=5&wx_lazy=1[/img][/align][align=center]（来源于网络）[/align]所以，尽管非损伤微测技术进入中国时间不长，但是发展十分迅速，不但以印丽萍、陈少良、沈应柏、许卫峰、罗志斌等中青年科学家，利用非损伤微测技术快速将自身科研提升至世界水平，刚才所列的武维华、王立伟等国内膜片钳技术专家也已利用NMT，并结合膜片钳技术做出了世界一流的科研成果。[b]3） 技术现状[/b]全自动膜片钳虽然已于近年面市，但是传统的膜片钳技术仍然在生理、相关基因功能验证等基础研究领域，发挥着不可替代的作用。而全自动膜片钳虽然提高了数据的单位产出量，但似乎更多地被应用于药物研发、药效评价等应用领域，其对科研基础理论的贡献和潜力还有待于观察。[align=center][img]data:image/gif base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAAEAAAABCAYAAAAfFcSJAAAADUlEQVQImWNgYGBgAAAABQABh6FO1AAAAABJRU5ErkJggg==[/img][img]https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_jpg/iaFShJzBuGDEbuf6P7NZBiavESu2yf2ug2aSo6YYWVabuqzRV3dKticXGNNbib3A4WMZAkVqhMibPWm0tAFjWHPPJ3Q/640?wx_fmt=jpeg&wxfrom=5&wx_lazy=1[/img][/align][align=center]（来源于旭月公司网站：http://xuyue.net）[/align]智能自动化的NMT传感器制备装置，已经于2016年在中国市场有售，标志着非损伤微测技术开启了追赶膜片钳自动化的步伐。尽管数据的单位时间产出量，即：高通量并不是非损伤微测技术的优势，但是，鉴于该技术的长处之一就在于它的实时测量，即在正常生理时间尺度内，揭示生物的活体生理功能。相反，将非损伤微测技术与膜片钳技术相比，比较容易一叶障目的误区就是把非损伤微测技术的应用限制在了只是生物膜的层面。其所谓‘成也萧何，败也萧何！’，膜片钳的高阻封接成就了它的单通道测量，但同时也制约了它的测量材料的灵活性。而反观非损伤微测技术，因为不接触被测材料，所以在材料的选择上就有了极大的自由度。特别是近年的科学发现表明，如我在里所述，人类的各种疾病的答案，不在基因层面（半个多世纪寻找癌症基因努力的失败就是例证），甚至不在细胞层面，这就给组织层面的研究打开了广阔的新天地。当我们环顾实验室四周，能够帮助我们研究活体组织的技术凤毛麟角，而像非损伤微测技术这样完全近乎无损的技术更是难觅。加之进一步的研究表明，比如癌症的发生发展是和其组织微环境的改变密切相关，那么，还有什么技术比非损伤微测技术，这一能够在活体状况下检测微环境中各种离子分子活性的技术更合适的呢！山西医科大学的祁金顺教授，利用非损伤微测技术建立起的脑切片组织生理检测试验体系，就是这方面的一个很好的例证（具体描述请浏览： http://e.vhall.com/133934064或http://xbi.org/index.php?option=com_content&view=article&id=516&Itemid=907&lang=cn）。[b]4） 未来趋势[/b]每个技术都有它自己的特色，很难完全取代对方。因此，利用各自优势，膜片钳与非损伤微测技术配合使用将是一个趋势。这里已经有一些尝试，大家可以参考一下相关文献（http://xbi.org）。下面我就几个非损伤微测技术可以弥补膜片钳技术局限的地方跟大家分享一下，以便大家更好地结合两者使用。[align=center][img=,397,211]https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_jpg/iaFShJzBuGDEbuf6P7NZBiavESu2yf2ug2x4Tml1DWpOIDDI3WicJ2o6tvFQYUiaJqfCwnoGdkw1nT5D3wSFghk3Dg/640?wx_fmt=jpeg&wxfrom=5&wx_lazy=1[/img][/align][align=center][img]data:image/gif base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAAEAAAABCAYAAAAfFcSJAAAADUlEQVQImWNgYGBgAAAABQABh6FO1AAAAABJRU5ErkJggg==[/img][/align][align=center](来源于美国扬格公司网站：http://youngerusa.com/)[/align]（a）‘零’电流问题如上图所示，当有等电荷的两种离子进出同一片细胞膜的时候，膜片钳技术将检测不到电流。而此刻科研人员可以利用非损伤微测技术的多传感器同时测量优势进行研究。（b）其它离子运输载体和方式的研究我们知道除了离子通道，生物细胞还有其它多种离子转运方式，它们与离子通道一起，共同担负着维持细胞和乃至整个生物体活性的各种生理功能。正如在[url=https://mp.weixin.qq.com/s?__biz=MzA3OTE0NTI3OQ==&mid=2651820382&idx=1&sn=156a5c79f5aba52283f147a9d4cb1e7f&chksm=844cc10eb33b48188af3c5762db8b3b21a30d311c3bbae3f85ad8fd71abbd91872704d321d35&scene=21#wechat_redirect]（2）时间与空间[/url]中所说，将PC与NMT这两个跨越不同时间和空间的技术相结合使用，对于我们更加全面的了解生物现象的本质，有着不可替代的作用。（c）分子转运的研究毫无疑问，NMT非损伤微测技术在O2，H2O2，葡萄糖，乙酰胆碱等与生命活动密切相关的小分子，大分子跨膜运输方面，将极大补充PC技术在这方面的不足。（d）物理机械损伤尽管‘高阻封接’成就了PC的单通道测量，但是其巨大的机械损伤，被证明不但是的确存在的，而且的确会产生错误的结果。那么，有另外一个相对独立的技术对PC进行验证，对科学研究的准确性无疑是个巨大利好。[align=left]广州暨南大学的王立伟，陈丽新教授，利用NMT与PC结合，发现并推翻了PC过去错误的结论的故事很好地诠释了这一点。（具体描述请浏览：http://e.vhall.com/133934064[/align][align=left]或 http://xbi.org/index.php?option=com_content&view=article&id=516&Itemid=907&lang=cn）[/align][b]5）结束语[/b] [img=,280,231]https://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_jpg/iaFShJzBuGDEbuf6P7NZBiavESu2yf2ug26453BRepj8GYQsp578CpkibGszw4qrzbIkhsyxAH8vJxhAIACpICQjg/640?wx_fmt=jpeg&wxfrom=5&wx_lazy=1[/img][align=center][img]data:image/gif base64,iVBORw0KGgoAAAANSUhEUgAAAAEAAAABCAYAAAAfFcSJAAAADUlEQVQImWNgYGBgAAAABQABh6FO1AAAAABJRU5ErkJggg==[/img][/align][align=center]（来源于网络）[/align]在一次社会名流的聚会上，当有人用略带轻蔑的口吻对发现美洲新大陆的哥伦布说到：“你发现美洲没有什么了不起的，只不过是你的运气比别人好些罢了！”。哥伦布没有马上说什么，而是让人拿来一个鸡蛋向在场的所有人发出挑战，看谁能够把这个鸡蛋立在桌子上。读者们中很多人知道这个故事的结局，就是在这些人费了九牛二虎之力失败之后，哥伦布将鸡蛋的一端击碎后立在了桌子上。Neher和Sakmann发明膜片钳“不过”是在前人电生理的基础上，略微地在玻璃电极与细胞膜接触时施加了一点点负压形成‘高阻封接’而已。同样NMT非损伤微测技术的诞生，Jaffe和Newman他们“也无非” 就是让离子/分子传感器动了起来，进行‘两点测量’而已！但就是这一看似细微的‘高阻封接’，这一看似平常的‘两点测量’，让科学家能够检测到pA（10[sup]-12[/sup]）级的微弱单离子通道电流，让科学家能够检测到单个细胞离子（比如Ca[sup]2+[/sup]）分子（比如O[sub]2[/sub]）的10[sup]-15[/sup]级进出流速。他们就是科学界的哥伦布，帮助科学家们发现了科学世界的新大陆！同学们，老师们，朋友们，现在非损伤微测技术已经来到了你的身边，中国人在一些领域已经实现了弯道超车，能否先于他人把这个‘蛋’矗立在你们各自的研究领域，即是摆在你们面前的挑战，大家准备好了吗？！[b]参考文献[/b][list][*]美国对不同研究领域的投入http://www.bu.edu/research/articles/funding-for-scientific-research/[/list][list][*]Verkhratsky, Alexei & Parpura, Vladimir. (2014). History of Electrophysiology and the Patch Clamp. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.). 1183. 1-19. 10.1007/978-1-4939-1096-0_1.[/list][list][*]Uncoupling of K+ and Cl- transport across the cell membrane in the process of regulatory volume decrease. Linjie Yang, Linyan Zhu, Yue Xu, Haifeng Zhang, Wencai Ye, Jianwen Mao, Lixin Chen, Liwei Wang. Biochemical pharmacology 84 (3), 292-302[/list][list][*]非损伤微测技术实时检测海马脑片跨膜钙离子流。《生理学报》2017年 第4期 | 李甜 原丽 张军 焦娟娟 祁金顺[*]文中相关文献可以到旭月研究院网站下载： http://xbi.org/index.php?option=com_rsfiles&view=rsfiles&Itemid=304&lang=cn[/list][align=center][img]http://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_jpg/iaFShJzBuGDF6tmTJTMX4uic43l9icahVSUTxSOVWpIzWuU9op0axQeUZlOd197ib0J6kUyJDXf9MJrWibHg0hicvMCw/640?wx_fmt=jpeg&wxfrom=5&wx_lazy=1[/img][/align][align=center][/align][align=center][b]旭月版权所有,转载注明出处.[/b][/align][align=center][img=,,130]http://mmbiz.qpic.cn/mmbiz_jpg/iaFShJzBuGDFvv5AgpUstNSuO10Yztkuqee9ozBmgmqkRl5Df8F3bvfhr0YroolbwMI0ScicdJDTJyTPYXIc1qvw/640?wx_fmt=jpeg&wxfrom=5&wx_lazy=1[/img][/align]