红外分析法实验

▶#日立实验#荧光分析法某些物质的分子能吸收能量而发射出荧光，根据荧光的光谱和荧光强度，对物质进行定性或定量的方法，称为荧光分析法。荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、需样量少和方法简便等优点，它的测定下限通常比紫外-可见分光光度法低2~4个数量级，在生化分析中的应用较广泛；既可依据发射光谱特征，又可依据激发光谱特征进行测试。摘要本实验采用日立F-4700荧光分光光度计对不同浓度硫酸奎宁溶液进行测试。实验原理1.硫酸奎宁的分子结构特征硫酸奎宁属生物碱类抗心率失常药，其分子具有喹啉环结构，可产生较强的荧光，可直接用荧光法测定其荧光强度，由校正曲线求出回归方程进而求出试样中奎宁的浓度。2.定量依据与方法2.1定量依据：在低浓度时，溶液的荧光强度与溶液中荧光物质的浓度呈线性关系。2.2定量方法：标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。测试条件测试结果配置不同浓度硫酸奎宁标准样品，测试其标准曲线如下结论本次实验采用荧光分析法对硫酸奎宁溶液进行定量测试。结果表明，日立荧光分光光度计测定硫酸奎宁溶液标准品线性良好，同时对未知浓度样品进行测试，结果准确，测试结果不受其它干扰物质影响，说明日立荧光分光光度计灵敏度高，满足用户需求。END公司介绍：日立科学仪器（北京）有限公司是世界500强日立集团旗下日立高新技术有限公司在北京设立的全资子公司。本公司秉承日立集团的使命、价值观和愿景，始终追寻“简化客户的高科技工艺”的企业理念,通过与客户的协同创新，积极为教育、科研、工业等领域的客户需求提供专业和优质的解决方案。 我们的主要产品包括：各类电子显微镜、原子力显微镜等表面科学仪器和前处理设备，以及各类色谱、光谱、电化学等分析仪器。为了更好地服务于中国广大的日立客户，公司目前在北京、上海、广州、西安、成都、武汉、沈阳等十几个主要城市设立有分公司、办事处或联络处等分支机构，直接为客户提供快速便捷的、专业优质的各类相关技术咨询、应用支持和售后技术服务，从而协助我们的客户实现其目标，共创美好未来。

p style="text-indent: 2em "以高通量测序为代表的现代分子生物学技术的突飞猛进，正在对传统的医学检验产生影响，目前已在无创产前筛查、染色体拷贝数变异筛查、遗传病致病位点筛查、胚胎植入前诊断等临床检验中心应用。随着国家食品药品监督管理局接连批准基于高通量测序技术（NGS），以及伴随诊断标准审批的多基因肿瘤突变联合检测试剂盒，illumina的仪器也在前几天获批，NGS已经成为医学检测领域不可忽视的重要技术。/pp style="text-indent: 2em "不同于往常的检测手段，从样本处理到检测结果，NGS存在诸多繁杂的步骤。只有保证检测结果的准确性，临床应用才能落到实处。在NGS实验室的管理体系上不断优化，力求打造管理科学化，操作规范化，方法标准化及体系国际化的实验室，是该行业大家最关心的话题。今天我就结合在工作中践行的实际情况，浅谈“5M1E”分析法在NGS实验室管理中的应用。/pp style="text-indent: 2em "“5M1E”其实就是对全面质量管理理论中六个影响产品质量的主要因素的简称，是指6种分析维度与方法，其中五项的英文是以M开头，一项是以E开头，分别为：“5M”：Man（人），Machine（机），Material（料），Method（法），Measurement（测）；“1E”：Environment（环）。/pp style="text-indent: 2em "一、 人/pp style="text-indent: 2em "人员是NGS实验室管理中最活跃的因素，对实验室的全部活动起着主导和支配作用，是决定实验室检测质量的根本因素。/pp style="text-indent: 2em "1、 专业与能力：因二代测序实验操作的复杂性，对NGS检验人员的要求不能仅仅停留在简单进行仪器操作这个层面上。为保证检验结果的快速、准确，检验人员不但要熟练掌握各种仪器的操作，更要了解可能影响检验结果的全方位因素，检验人员在技能方面必须有分子生物学的专业知识和技术能力。/pp style="text-indent: 2em "2、 教育与培训：人员的培训在保证检验质量中尤为重要，从事二代测序的检验人员在上岗前必须先取得临检中心《临床基因扩增实验室技术人员培训合格证》和NGS技术的理论与技能培训。分析人员需要经过生物信息学的培训。/pp style="text-indent: 2em "3、 专才到全才：为了让检验人员可以在保证质量的前提下快速上岗，可以将NGS实验室岗位进行细分，如收样、提取、建库、质检纯化、上机测序等，先按单岗进行培训考核上岗，定岗定区域，等熟练后再进行全方位培训，这样有助于实验室人员的安排，也有助于检测结果的准确性。/pp style="text-indent: 2em "二、 机/pp style="text-indent: 2em "这里是指直接或间接用于检测分析的，对检测结果有影响的仪器设备及有关辅助性仪器设备等，这里包含了测序后数据分析软件。/pp style="text-indent: 2em "1、 仪器设备的校准与确认：对于检测设备，经过采购、到货验收、安装调试等过程后，首先在设备投入使用前进行校准或验证确认，确保用于检测的设备及其软件达到检测的准确度和规范性。当校准报告给出一组修正因子时，需要将其校准因子在实际中正确运用，否则会有仪器偏差引入。/pp style="text-indent: 2em "2、 数据分析软件：这是NGS实验室特有的环节，实验室需要用商品试剂配套的软件进行数据分析，并确认使用软件的版本和数据库的现行有效版本；数据需要专业的生信人员进行分析，需要在数据预处理、数据比对、数据质控、分析判断等每个流程进行质控，确保数据分析的准确性。/pp style="text-indent: 2em "3、 仪器的配套使用：需要使用商品试剂申报时的配套仪器型号，如燃石人EGFR/ALK/BRAF/KRAS 基因突变联合检测试剂盒（可逆末端终止测序法）受理号为CSZ1700157，配套仪器为Illumina 公司生产的MiSeqDx，虽然Illumina公司有MiSeq、MiniSeq、NextSeq500等不同型号的测序仪，但在检测过程中必须选用MiSeqDx型号的仪器，否则仪器之间的差异会影响检测结果的准确性。/pp style="text-indent: 2em "4、 设备的标识：设备标识是设备管理过程中非常重要的一个环节，设备要有一个唯一性编号的标识，这个编号是唯一性的，即使是同样型号的仪器也不允许重复，只有这样才能做到检测数据的溯源性要求。还有设备的运行、维修、暂停等状态也需要做好标识，防止设备的非预期使用影响到检测结果。/pp style="text-indent: 2em "5、 设备的维护和保养：设备要定期做好维护和保养，一般校准和验证的周期为1年，中间可以采用标准物质或同型号设备进行比对，确保设备的性能，保证结果的准确性。如设备有大的关键零件的维修更换、精密仪器的位置搬动等，需要对设备的性能重新进行验证确认。如测序仪等设备对外界环境有温湿度要求的，要确保环境符合要求，并做好监控和记录，否则外界环境对检测结果也会存在影响。/pp style="text-indent: 2em "三、 料/pp style="text-indent: 2em "这里是指不局限于实验室的试剂和耗材，还包含检测的样本，检测记录和报告。/pp style="text-indent: 2em "1、 样本：要确保NGS检测结果的准确性，样本的质量起着关键性的决定作用，实验室应制定正确采集处理原始样品、标识及样品质检标准的文件化程序。/pp style="text-indent: 2em "1.1 采集活动前的指导：如采集的方法、影响采集方法的因素，样本采集的类型和量、样本存储的容器和必需添加物。/pp style="text-indent: 2em "1.2 采集活动的指导：采集患者身份的确认，采集样本的原始标识，采集时间等。/pp style="text-indent: 2em "1.3 样品的存储和标识：从样品接收开始直到报告出具，样品存储温度的要求、使用的保存液等，在整个实验室流转过程中都具有唯一性标识，防止混淆。除了样本本身的区别标识，还应该有样品的状态标识，如待检、检测中、已检三种状态，分别存放在不同的区域中。/pp style="text-indent: 2em "1.4 制定样本的质检标准：如石蜡包埋(FFPE)的非小细胞肺癌(NSCLC)组织样本，肿瘤细胞含量应达20%以上，提取的DNA量应大于50ng才能开始NGS的下一步检测。如样本质检不合格需要重新进行采样，如不进行样本的质检直接进入下一道工序，到最后发现检测结果不符合要求，耗时又耗钱，耽误患者用药时间。/pp style="text-indent: 2em "2、 试剂/pp style="text-indent: 2em "实验室应制定用于试剂的接收、验收、使用、存储的文件，试剂到货时进行外观及性能的进货验收，按照存储温度及批号规则进行试剂的存放，按照批号、效期的原则录入到系统并做好库存卡，试剂领用做到先进先出。商品化试剂在用于临床样本检测应进行有效的性能验证（如准确性、灵敏度、特异性）。/pp style="text-indent: 2em "NGS的商品试剂因都是低温保存，一般都会有开瓶有限期和反复冻融次数要求，实验室在使用过程中需要及时记录开瓶日期和冻融次数，使用时可根据需要进行分装，避免反复冻融。若分装后的物料需要继续保存，则应注明物料名称、原瓶开瓶日期、分装日期等信息，确保试剂的可靠性。/pp style="text-indent: 2em "3、 耗材/pp style="text-indent: 2em "NGS实验室都会用到各种规格的移液器枪头、PCR管、离心管等一次性耗材，市场上有众多的厂家及规格型号，在NGS实验过程中请确保使用无菌、滤芯、低吸附的规格型号；同时确保无脱氧核糖核酸酶（DNase）和核糖核酸酶（RNase）污染。/pp style="text-indent: 2em "4、 记录和报告/pp style="text-indent: 2em "记录和报告也是一种特殊的物料，记录设计要有检测样本、使用的设备编号、使用的试剂批号、检测日期、检测人、复核人、检测结果的原始数据等信息，方便追溯。每个实验环节需要及时、准确、真实填写各种记录，定期整理归档管理。检测报告内容应包含但不局限于患者人员信息、病历信息、样本信息、所用试剂和分析软件信息、检测结果及解释，报告人及有签发报告资质人员的签名。报告应简洁扼要、通俗易懂。/pp style="text-indent: 2em "四、 法/pp style="text-indent: 2em "为了使NGS实验规范管理，操作标准统一，保证检测结果的准确性，需要制定各种程序性文件、作业指导书、记录表单，文件保持现行有效版本，方便员工随时取阅，做到“有法可依、有法必依、执法必严、违法必究”。/pp style="text-indent: 2em "1、 程序性文件：可以参照CNAS-CL02:2012《医学实验室质量和能力认可准则》的要素建立实验室管理的质量手册和程序性文件。/pp style="text-indent: 2em "2、 操作性规程：可以采用图文并茂的方式建立实验操作细节、设备操作规程、质控方法及质控标准等。/pp style="text-indent: 2em "3、 记录表单：可以根据NGS的工序如收样、提取、建库、纯化、上机测序各工序形成全套的实验操作记录；另外如设备使用、维护、保养记录、温湿度监控记录、试剂的配置记录等配套的各类表单，均由质量部受控发放使用。/pp style="text-indent: 2em "五、 测/pp style="text-indent: 2em "为了提高检测结果准确性和可靠性所采取的有关措施和活动。/pp style="text-indent: 2em "1、 实验室间质评（EQA）：也叫室间质量评价，是国家卫健委利用各实验室间的比对来确定实验室能力的活动，实际上它是指为确保实验室维持较高的检测水平而对其能力进行考核、监督和确认的一种验证活动。这是NGS实验室证明自己能力的一种很好的方式，也是自己实验室技术能力在行业中展示的一个窗口，应该积极报名参加。/pp style="text-indent: 2em "2、 实验室间比对：实验室间比对是按照预先规定的条件，由两个或多个实验室对相同或类似的测试样品进行检测的组织、实施和评价，从而确定实验室能力、识别实验室存在的问题与实验室间的差异，是判断和监控实验室能力的有效手段之一。/pp style="text-indent: 2em "3、 人员比对：为了提高自己实验室人员的技能，建议定期开展人员比对活动，这是维持和提高检验人员能力水平的一种很好的手段。倡导实验室形成你追我赶的氛围，不断提升实验人员的技能。/pp style="text-indent: 2em "4、 盲样测试：能直接反映实验室的仪器设备和技术水平，可以作为实验室技术人员转正考核的一种手段。/pp style="text-indent: 2em "5、 阳性对照和阴性对照：每次检测都必须放置阳性对照和阴性对照，作为最终判断结果的参考依据。阴性质控品(NC)的检测结果应为阴性，若其中有突变检出，说明环境中可能存在DNA污染源。阳性质控品(PC)的检测结果应为某个基因突变对应阳性，如果突变未检出，说明试剂盒性能不理想或操作过程有误，此次检测结果无效。/pp style="text-indent: 2em "六、 环/pp style="text-indent: 2em "这里是指检测过程中的实验室硬件环境。/pp style="text-indent: 2em "1、 实验室设计布局：NGS实验室设置应该严格按照国家卫健委高通量测序实验室的要求进行，申请临床基因扩增检验实验室验收，标准化分区及空气流向，确保工作有序，互不干扰，防止污染。/pp style="text-indent: 2em "一般肿瘤领域二代测序分为试剂准备区、样本与文库制备区、DNA打断区、杂交捕获区（扩增一区）、文库扩增区（扩增二区）、文库检测区、测序区、电泳区共八个区，每个房间压差依次梯度≥5Pa，设置PCR专用走廊和缓冲间，在缓冲间内，可设置正压，使室内空气不流向室外，室外空气不流向室内。严格人流物流分开，严格遵守从一区到八区的单一方向制度，不得反向进入前一个区，尽量减少在实验区内不必要的走动，以减少交叉污染。/pp style="text-indent: 2em "2、 区域管理：在各个实验区使用带有明显区别标志的工作服和物品（如不同颜色），每个工作区域均有专用的仪器设备，各区域仪器设备须有明确的标记，避免设备物品如加样器等从其各自的区域内移出。当工作人员离开时，不得将本区的工作服、手套、口罩和物品带到其他区域，从而造成不同的工作区域间设备物品发生混淆污染。/pp style="text-indent: 2em "3、 环境卫生：每个区域都应该有独立的清洁工具，每个区域的清洁工具不得混用，清洁时按照从一区到八区的单一方向制度。工作结束后用75%的乙醇擦拭工作台面，用紫外线灯（建议安装无臭紫外灯）进行照射，同时注意实验室的通风换气。/pp style="text-indent: 2em "国家原卫计委李大川处长在近期会议上肯定了近年来分子检测在临床中的突出贡献，随着精准医疗的发展，分子检测不仅有助于疾病的诊断分类，而且加深了人们对疾病的认识，指导疾病的靶向治疗。但是NGS检测的质量控制仍然存在问题：实验室设计、实验室人员水平、质量保证手段等。我们只有有效运用“5M1E”分析法，规范NGS实验室管理，保证质量，向临床提供真实、客观、准确的检测结果，才能更好地为大众健康服务。/p

国际衍射数据中心（ICDD）出版发行的标准衍射卡片即PDF（Powder Diffraction Files）卡片数据库，主要用于结晶材料的物相鉴定和定量分析。最常用的粉末衍射法鉴定物相的基本方法称为Hanawalt Method，该方法鉴定物相的主要思路是收集粉末材料的XRD图，抽取物相衍射峰的d-I列表（d：晶面间距，I为衍射强度），利用XRD图中的三强线作为检索依据，通过比对标准PDF卡片库中收录的物相的标准衍射数据来确定可能的物相，随后再将XRD图中其余的衍射峰与PDF卡片中的衍射峰进行比对，确定XRD图中物相的种类[1]。图1：标准PDF卡片示意图图2：利用PDF卡片鉴定结晶物相 对于结晶性比较好的材料所收集的XRD数据，利用ICDD出版发行的PDF-2数据库即可满足Hanawalt Method分析XRD数据中的物相种类。对于结晶性比较差的材料，如聚合物、纳米态材料、黏土矿物等，这些非晶或半结晶材料所收集的XRD数据无明显的特征衍射峰或特征衍射峰半高宽、不对称度等很大，无法采用传统的Hanawalt Method完成物相鉴定。图3：采用Hanawalt Method无法分析非晶材料的物相 ICDD出版发行的PDF-4系列的数据库中，不仅仅收录了材料的标准衍射数据d-I列表，部分PDF卡片也收录了非晶、半结晶、纳米材料等纯相物质的衍射图，即Raw Diffraction Data （PD3），如下图所示：图4：PDF卡片中收录纯相物质的衍射图（Raw Diffraction Data，PD3）PDF-4系列数据库中所收录的纯相物质的衍射图（PD3），在物相鉴定的过程中支持全图分析法（Total Pattern Analysis）来分析XRD所对应的物相，在PDF数据库中该功能称为计算相似指数（Calculating Similarity Indexes）。相似指数是描述导入的实验XRD图与标准衍射卡片PDF卡片中PD3衍射图的相似性，具体采用数值表示，数值越小，表示二者的匹配越好，理论上完美的匹配值为0。相似指数（Similarity Indexes）来分析物相详细信息可参阅参考文献[2]和[3]，计算相似指数的公式如下：需要说明的是全谱分析法分析XRD物相种类适合与实验XRD数据中只含有一个物相或XRD数据对应只含有一个主要物相。由于相似性指数的计算是基于两个衍射图中每个衍射数据库点的比较，因此在做该分析之前，一定要确保PDF卡片中PD3数据的设置参数和待分析的XRD数据收录仪器参数一致，从而将导入的XRD数据进行物相鉴定，以期得到正确的分析结果。下面以采用全图分析法来分析聚维酮（Povidone）的XRD数据是否为纯相为例来进行分析过程的说明，聚维酮主要作为药物合成的原料，为一种重要的血容量补充药剂， 也可作为增稠剂、助悬剂、分散剂、助溶剂、络合剂、前体药物制剂载体剂、粘合剂、成膜材 料、包衣材料和缓释材料。由于聚维酮（Povidone）是一种聚合物，且应用在药物领域，因此：步骤1：在PDF卡片界面中，利用检索PDF卡片的功能，检索出子领域为Pharmaceutical 和Polymer 中所收录的所有含有Raw Diffraction data的符合条件的PDF卡片：图5：含有Raw Diffraction data，属于Pharmaceutical 和Polymer领域的PDF卡片步骤2：选择Tools--- Calculate Similarity Indexes—导入待分析的XRD数据： 图6：选择导入的XRD数据，计算相似指数主要设置的说明：Prefer Raw Diffraction Data (PD3 Patterns)：选中该选项后，将导入的实验XRD数据与当前PDF卡片中的的纯相原始衍射图（PD3）进行比较（如果可用）。纯相原始衍射图（PD3）通常为纳米晶、半晶或非晶材料。未选中该选项时（或者如果PDF条目没有原始衍射图案），导入的实验XRD数据将与当前PDF卡片中的模拟衍射图案进行比较。Use Individual Overlapping Region：选择该选项后，相似度指数计将基于导入实验XRD数据的x轴的范围和当前PDF卡片中纯相衍射图（PD3）。Use Set-wide Overlapping Region：选择该选项时，相似度指数计算将基于导入实验XRD数据的X轴区域以及搜索结果中所有PDF卡片中的纯相衍射图（PD3）的X轴区域。导入实验XRD数据后，将自动计算每个PDF卡片与实验XRD数据的相似性指数，并将相似值列在检索结果中，于计算的x轴区域的范围将显示在相似指数列表中的括号中。选择不同的PDF卡片与实验XRD图比对结果。 图7：全图分析法分析非晶态聚维酮（Povidone）其中红色为导入的XRD图，蓝色为PDF卡片中收录的纯相衍射图（PD3）参考文献：[1] JD Hanawalt, HW Rinn, Identification ofCrystalline Materials, Clssification and use of X -ray Diffraction Patterns, Industrial& Engineering Chemistry, 1936, ACS Pulication.[2]Karfunkel, H. R., et al. "Continuous similarity measure betweennonoverlapping X‐ray powder diagrams of different crystal modifications." Journalof computational chemistry 14.10 (1993): 1125-1135.[3]Hofmann, Detlef Walter Maria, and Ludmila Kuleshova. "New similarity indexfor crystal structure determination from X-ray powder diagrams." Journalof applied crystallography 38.6 (2005): 861-866.