肿瘤标志物检测

肿瘤标志物联合检测法在早期发现、病程监控、机制研究、肿瘤转移及预后监测中应用 据统计，我国每年新患癌症的病人约160万人，每年因癌症死亡的人数约130万人。我国大、中城市居民的许多死亡原因中，癌症是第一位死因。 世界卫生组织作出最新权威性结论，癌症患者如能早期发现，治愈率可达80%以上。肿瘤标志物可以比影像学更早的发现肿瘤，因而对于治疗癌症意义深远。肿瘤标志物的分泌来源于肿瘤微环境的基质细胞以及肿瘤细胞，存在于细胞、组织或体液中，能用化学或免疫方法定量证实肿瘤存在，监测肿瘤治疗和预后的物质。 图1：常见肿瘤标志物联合检测方案 目前为止，还没有找到灵敏度、特异性100%的肿瘤标志物。单一指标、单一因子的检测很难准确的实现肿瘤早期检测、病程监控及预后治疗效果的评估等。如传统的Elisa方法，仅能进行单一蛋白因子的检测。若要提高检测的准确性和特异性，需要进行多个Elisa实验检测不同的蛋白因子。以10个蛋白因子检测为例，需要10个Elisa试剂盒，至少1ml的样本，一周时间才能得到结果。无论从人力、财力还是时间和样本量来说，都不是很好的选择。而且10个因子不是同时检测也可能造成结果的误差。图2 检测对象越丰富疾病区分度越好（class代表指标分类，marker代表具体指标） 目前，实现肿瘤标志物联合检测的最便捷最高效的技术手段之一就是xMAP技术。xMAP技术基于不同荧光编码的微珠。每一种编码微珠标记一种可捕获相应目标分子的抗体，根据检测靶标的数量，选择1-100种标记的微珠，混合后与样品中待测的靶标分子作用，然后在液流驱动下逐个通过检测窗口，两束不同波长激光对每个微球进行检测，635nm激光检测微球的色标编码从而确定检测的靶标，532nm激光检测相应靶标上的荧光标记进行定量，通过计算机分析和标准曲线拟合，直接对每一种目标分子进行定量。该技术利用Luminex多功能液相芯片平台实现了对蛋白、核酸等靶标分子的多重检测，是唯一被纳入美国临床实验室质控的高通量技术，被誉为真正的临床型生物芯片。 图3 xMAP技术原理图 视频1：xMAP技术原理及Milliplex技术平台介绍基于xMAP技术的多重检测平台的优势：- 多重检测：实现1-500重因子同时检测，为微量样本的精确检测提供技术保障；- 高灵敏度：精密的光学设计提升检测灵敏度，可低至0.04pg/ml；- 快速/高通量：96/384孔板自动化高通量检测，每小时数据量可达9,600个结果；- 微量样本：仅需10-50ul的样本量使得跟踪动物模型的阶段性变化成为可能，避免个体差异带来的实验误差。 目前，已有几千篇文献报道利用xMAP技术进行肿瘤标志物联合检测以提高肿瘤检查准确性和特异性。例如，Irene等人采用非侵入性方法（血清）对卵巢癌6个标志物进行检测，发现6个标志物联合诊断比原来的单个CA-125检测准确率明显提升（95.3% vs 72%）,从而能够展开卵巢癌的早期治疗（图2）。 图4：Irene等人卵巢癌早期检测研究已发表于Clinic Cancer Research(IF: 8.19) 作为Luminex 最早的全球合作伙伴，Merck提供包括Luminex仪器、Milliplex高通量多因子检测试剂盒、Milliplex Analyst 软件和Biomarker service在内的一整套高通量多因子检测平台。Merck始终致力于生物标志物多重检测技术与研发，拥有三十多年的研发和服务经验。目前可以提供8个种属超过1200个蛋白因子的检测，涉及免疫、代谢、肿瘤、神经、信号通路、干细胞等多个热门研究领域，能够满足多数肿瘤标志物开发与诊断需求。此外，Merck已与全国各地肿瘤医院与研究所合作，提供检测平台和服务，积累了二十年检测与分析的经验，因此开设肿瘤标志物联合检测法应用专题，分享成功经验给广大临床及诊断研究工作者。 本专题将分成多期探讨肿瘤的早期发现、病程监控、机制研究、肿瘤转移及预后监测等方面的标志物多重检测应用。欢迎订阅Merck生物标志物期刊，掌握最新研究进展。 点击此处订阅 若以上链接无法点击，请扫描二维码。专题下一期预告：肿瘤早期诊断之多重生物标志物检测法默克生命科学Tel: 021-38529074Email: china.marketing.online@merckgroup.comweibo: 默克生命科学新浪微博wechat: 公众号默克生命科学

p style="text-align: justify "　　肿瘤具有高死亡率、高转移率和高复发率，是危害人类健康的重大疾病。诊断肿瘤的传统方法有病理组织活检、核磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)、电子计算机断层扫描(computed tomography，CT)、B超、X线胸片、内镜检查等。这些检查对于肿瘤早期的检测效果十分有限，部分检测方法不仅价格昂贵，且会给患者带来痛苦。因此，在肿瘤早期阶段开展快速、有效的检测十分必要，不仅可以达到早发现、早治疗的目的，还可以改善患者就医体验。肿瘤标志物的筛检对于肿瘤早期检测具有重要意义[1]。/pp style="text-align: justify "　　肿瘤标志物是指由肿瘤组织或宿主与肿瘤相互作用所产生的一类活性物质，能够提示肿瘤存在与生长变化。肿瘤标志物常常存在于血清、细胞、尿液、体液或组织中，常见的有癌胚蛋白、肿瘤抗原、酶类标志物、激素、糖类抗原等。肿瘤标志物检测具有操作便捷、标本易获取、非侵入性、价格低廉、易于动态监测疾病等优点。肿瘤标志物的检测对于肿瘤的预防、早期诊断与鉴别诊断、辅助肿瘤分类、疾病监测、指导治疗和预后判断有重要作用，可有效弥补其他医学技术对肿瘤诊断、治疗及预后判断的不足[2]。肿瘤标志物种类繁多，检测方法也各异，本文将几种常见肿瘤标志物检测方法的研究进展作一综述。/pp style="text-align: justify "　　span style="color: rgb(0, 32, 96) "strong1、放射免疫分析/strong/span/pp style="text-align: justify "　　放射免疫分析是一种传统的检测肿瘤标志物的方法，是将放射性核素检测技术与抗原抗体结合特异性的特点相结合，以定量微量物质。放射免疫分析多使用放射性核素125I，因其具有放射性高、易标记、衰变过程中释放的射线易于被检测等优势，逐渐替代了3H和14C而被广泛使用。放射性核素标记具有高灵敏度、易于商品化等优势，曾被广泛应用，但与其他方法[3]相比，存在试剂盒使用寿命短、有放射性污染风险等缺点，目前已逐渐被其他检测方法取代。/pp style="text-align: justify "　span style="color: rgb(0, 32, 96) "strong　2、化学发光免疫分析/strong/span/pp style="text-align: justify "　　化学发光免疫分析是目前常用和较为成熟的肿瘤标志物检测技术，其利用化学发光物质作为标记物，根据发光信号的强度来判断待测物质的量。自1928年德国化学家Albrecht发现鲁米诺的化学发光特性后，该检测技术由于灵敏度高、快速、线性范围广、仪器结构简单、适合小型化、无放射性危害等优点得到不断发展[4，5]。化学发光免疫分析为化学发光法，使用直接发光物质(如吖啶酯)标记抗体，或使用酶类催化剂(如辣根过氧化物酶)[6]标记抗原抗体。将化学发光技术与微芯片电泳化学发光(microchip-electrophoresis chemiluminescence，MCE-CL)等技术联合使用，具有效率高、分析快、自动化程度高、需要更少样品和试剂的优点[7，8]。/pp style="text-align: justify "　　传统化学免疫分析采用酶标技术，用辣根过氧化物酶催化鲁米诺的免疫测定技术曾被广泛使用，目前的免疫测定系统通常使用信号探针标记抗体并进一步测量目标分析物浓度。但这类天然酶具有稳定性差、来源有限、对环境变化敏感、易受环境影响而变性等缺点，且标记过程通常会损害抗体分子的生物活性，因而基于金属及金属复合物[9，10]、磁性纳米颗粒[11]、量子点[12]等催化发光底物的无酶免疫系统[13]不断发展，将电化学技术和化学发光相结合检测肿瘤标志物，兼具了化学发光的高灵敏度和电化学的时间、空间可控性[14，15]的优点。有研究人员以CuS纳米粒子作为过氧化物酶模拟物，设计了一种新型的无标记化学发光(chemiluminescence，CL)免疫方法测定甲胎蛋白，与基于酶标的CL免疫测定法相比，提出的无标记测定模式更简单、价廉、快速。采用无标记的CL免疫测定法测定甲胎蛋白的线性范围为0.1~60ng/mL，检出限为0.07 ng/mL，且此CL免疫测定系统显示出良好的特异性、可接受的重复性和良好的准确性[16]。/pp style="text-align: justify "　　span style="color: rgb(0, 32, 96) "strong3、酶联免疫吸附试验/strong/span/pp style="text-align: justify "　　酶联免疫吸附试验是一项临床上已普及的检测技术，这一技术将抗原或抗体包被于固相支持物上，将酶标抗原或抗体加入抗原抗体复合物中，通过底物使酶显色来达到检测目的。不同的研究人员会采用不同的酶联免疫吸附试验策略，如使用单克隆多克隆抗体[17]及嵌合抗体[18]来开发肿瘤标志物检测试剂盒。酶联免疫吸附试验被开发后其检测系统得到不同的优化，如凝集素及生物素-亲和素系统[19]在酶联免疫吸附试验中的应用大大增强了其检测的敏感性，荧光素酶夹心酶联免疫吸附试验系统[20]也使检测的敏感性不断增强。酶联免疫吸附试验不仅适用于对单一分析物的测定，在多个分析物同时存在时，同样具有良好的适用性[21]。/pp style="text-align: justify "　　除酶联免疫吸附试验外，越来越多的研究集中于开发具有酶样活性的模拟酶[22]。ZHANG等[23]以Cu2+作为助催化剂，利用Cu2+/Ag-AgI复合物作为催化剂具有在可见光下使3，3´ ，5，5´ -四甲基联苯胺(3，3´ ，5，5´ -tetramethylbenzidine，TMB)颜色产生变化的特性，构建了夹心型比色法，通过监测TMB溶液的颜色变化以定量癌胚抗原的水平，其开发的比色免疫测定在血清样品分析中表现出良好的选择性、重复性和稳定性。/pp style="text-align: justify "　　span style="color: rgb(0, 32, 96) "strong4、免疫传感器/strong/span/pp style="text-align: justify "　　免疫传感器一直备受肿瘤研究者关注和青睐。将特异性免疫反应与生物传感技术相结合形成的生物传感器，其生物识别部分来自抗原与抗体的特异性识别和结合作用，通过理化换能器和信号放大装置将生物信号转变为电信号用于检测。与其他几种检测方法相比，免疫传感器具有灵敏度高、操作方便、设备简单、成本低、可实现实时动态检测等优势。目前，免疫传感器大部分处于试验阶段，正向高通量、商品化发展，以满足临床大样本检测的要求，随着技术的不断成熟，有望成为肿瘤标志物的新型检测手段。检验医学网/pp style="text-align: justify "　　金属纳米材料由于拥有独特的光学、电子和催化特性常被用于构建免疫传感器[24，25]。LIU等[26]使用多孔铂纳米颗粒和PdPt纳米笼同时测定肿瘤标志物癌胚抗原和甲胎蛋白，利用多孔铂纳米颗粒较大的表面积和较强的导电性，PdPt纳米笼优异的催化性能及高负载能力，增强和放大响应信号，实现了对双重分析物的灵敏测定。另外，使用纳米合金材料制作的传感器，与使用单一金属材料相比具有更好的生物相容性，金属之间良好的协同作用使传感器催化性能进一步被放大。ZHANG等[27]使用PdPt纳米颗粒，以石墨烯片和多壁碳纳米管作为传感平台，组成纳米复合物修饰电极，来测定肿瘤标志物潜伏膜蛋白-1，比单独使用Pd纳米粒子具有更高的过氧化物酶活性，PdPt凹面不仅可以提供较大的表面积，还可以提供更丰富的催化反应活性位点。/pp style="text-align: justify "　　碳纳米材料，包括单壁碳纳米管、多壁碳纳米管、石墨烯、碳纳米纤维、碳球等，由于其良好的力学性能、较高的化学稳定性、特殊的电学性质、优异的机械性能和良好的导热性被广泛用于免疫传感器的制造，制造的传感器具有响应速度快、电子传递速率高、负载量大、吸附性好、催化活性等优点。LIANG等[28]研制了以双层酶修饰碳纳米管作为标记的夹心型免疫传感器，利用层层自组装技术将辣根过氧化物酶装配到多壁碳纳米管上，实现了信号放大，为临床分析的超灵敏检测提供了有力的支持。/pp style="text-align: justify "　　聚合物复合材料由于良好的氧化还原性能，被作为免疫传感器信号指示剂[29，30]。TANG等[31]用聚多巴胺-PB2+(PDA-Pb2+)纳米复合材料作为氧化还原体系，用壳聚糖-金纳米复合材料涂覆电极，对癌胚抗原进行敏感性的电流分析。利用聚合物复合材料制作的免疫传感器，因聚合物复合材料掺杂带来的半导体或导体性质，其活性可被调节，掺杂/去掺杂的可逆过程使其可检测不同的分析对象，扩大了检测范围。/pp style="text-align: justify "　　免疫传感器的制备除上述几种材料外，还常引入其他具有不同功能的材料来提高性能。如利用量子点高表面活性、小尺寸及对光、电、温度等敏感的特性，构建的传感器灵敏度较高[32，33] 利用磁性纳米粒子的磁效应构建的传感器抗干扰性好[34] 利用介孔材料良好的孔隙结构和界面结构构建的传感器，能够保持酶良好的活性和功能性 利用水凝胶构建的传感器稳定性好，水溶性高，能够对外界刺激产生响应并产生相应变化[35]。此外，利用羟基磷灰石(hydroxyapatite，HAP)纳米颗粒，利用HAP-NPs与钼酸盐的反应检测甲胎蛋白，构建的传感器选择性好、灵敏度高，且成本低[36]。/pp style="text-align: justify "　　span style="color: rgb(0, 32, 96) "strong5、蛋白组学/strong/span/pp style="text-align: justify "　　蛋白组学是近年来兴起的肿瘤研究领域热点之一，以蛋白质为核心，对蛋白质的表达模式和功能模式进行研究。蛋白组学技术具有高通量、微型化、自动化的优势，目前被广泛用于临床肿瘤学研究，为肿瘤标志物的研究提供了良好的平台，但同时具有检测成本昂贵、对技术人员操作要求高等缺点。/pp style="text-align: justify "　　span style="color: rgb(0, 32, 96) "①双向电泳/span/pp style="text-align: justify "　　双向电泳是蛋白组学的经典技术，是利用蛋白质的等电点和不同相对分子质量来分离蛋白质的一门技术。双向电泳是蛋白组学的核心技术之一，能够通过染色强度得到蛋白质翻译后修饰的信息，能够同时分离数千种蛋白质。但其有不能分辨低拷贝数蛋白、检测蛋白比估计总蛋白数少、耗时长、操作过程繁琐等缺点，不能实现完全自动化，研究者常将其与质谱技术联用以分离、鉴定蛋白质[37]，即将蛋白质用双向电泳分离后，运用质谱技术进行逐一鉴定，这也成为蛋白组学研究的核心技术。相差凝胶电泳在双向电泳的基础上利用不同的染色对2个样本进行标记，通量更高，提高了凝胶间的可比性，工作效率得到提升。/pp style="text-align: justify "　　span style="color: rgb(0, 32, 96) "②质谱技术/span/pp style="text-align: justify "　　质谱技术是将物质离子化，根据不同质荷比进行时间和空间的分离，进而获得样品的相对分子质量、分子结构等多种信息的分析方法。由于其具有高分辨力、高精度等特点被广泛用于多个领域。近年来，常用色谱-质谱技术，因其兼具了色谱的分离能力和质谱的鉴定能力，能够对蛋白质进行准确、快速的分析和定量[39，40]。基质辅助激光解吸飞行时间质谱和电喷雾电离质谱是经过改进的质谱技术，前者利用基质吸收激光的能量，得到肽质量指纹谱，通过检索数据库以鉴定蛋白质 后者利用电喷雾法，液相化多肽以鉴定蛋白质。这2种方法能保证电离时样品分子的完整性，不会使离子碎片化。检验医学网/pp style="text-align: justify "　　span style="color: rgb(0, 32, 96) "③蛋白质芯片/span/pp style="text-align: justify "　　蛋白质芯片是近十年来新兴的分析技术，即在支持物表面排列蛋白质探针以捕获目标蛋白，再通过检测器进行定性或定量分析。根据载体性质不同，可分为固相蛋白质芯片和液相蛋白质芯片，临床上常用来筛选和寻找肿瘤标志物。反相蛋白质芯片也是蛋白组学高通量方法[41]。蛋白质芯片不仅可用来研究蛋白质与蛋白质之间的相互作用，还可研究蛋白质与核苷酸间的相互作用，具有通量高、速度快、灵敏度高的优点。DUAN等[42]设计了一种蛋白质芯片，使用胶体纳米金标记葡萄球菌属蛋白A作为指标，应用免疫金银染色增强技术扩增检测信号，此蛋白质芯片可在不存在交叉反应的情况下检测乙型肝炎病毒抗体和丙型肝炎病毒抗体，并可在40min内提供结果，速度相对酶联免疫吸附试验等方法更快。YANG等[43]开发了一种微阵列芯片，首次使用硅和水凝胶作为微阵列的载体，构成的芯片具有二氧化硅和水凝胶两者的优点。/pp style="text-align: justify "　　span style="color: rgb(0, 32, 96) "④表面增强激光解析及电离飞行时间质谱/span/pp style="text-align: justify "　　表面增强激光解析及电离飞行时间质谱是将质谱与蛋白质分离技术相结合的技术，能够检测到其他传统方法检测不到的蛋白质，只需少量样品，检测时间短且重复性高，可分析复杂样品。该技术基于特殊芯片的表明增强吸附作用，将样品蛋白质吸附到芯片上后，将结合蛋白质解离成核电离子以绘制质谱图。将健康人与肿瘤患者的蛋白图谱进行比较，能够发现差异表达的蛋白质。JIN等[44]开发了一种对糖类抗原19-9正常的胰腺癌患者与健康或良性个体进行诊断和鉴别诊断的方法，使用与CM10芯片联合的表面增强激光解吸及电离飞行时间质谱分析相关样品，生成了具有不同蛋白质的诊断模型。/pp style="text-align: justify "　　span style="color: rgb(0, 32, 96) "strong6、分子生物学方法/strong/span/pp style="text-align: justify "　　检测肿瘤标志物的分子生物学方法包括聚合酶链反应(polymerasechain reaction，PCR)、荧光原位杂交技术(fluorescencein situ hybridization， FISH)、逆转录PCR、单链构象多态性(single-strand conformationpolymorphism，SSCP)、多种测序技术等。分子生物学技术具有高通量，特异性强、敏感性高等优势，但也存在价格昂贵、检测周期长等缺点。/pp style="text-align: justify "　　PCR是目前被广泛使用的一种简单、敏感、高效、特异和快速的，能在体外扩增DNA的技术。由经典PCR衍生出的技术被广泛应用于肿瘤标志物的检测，如逆转录PCR被用于口咽癌[45]、结直肠癌[46]、前列腺癌[47]、肺癌[48]等多种肿瘤的检测。甲基化特异性PCR是一种检测特异位点甲基化的技术[49]，检测DNA甲基化敏感性极高，KOIKE等[50]发现甲基化特异性PCR对于胃癌标志物的检出率高于逆转录PCR。此外，多种PCR衍生技术如扩增融合PCR、实时荧光定量PCR等也被运用于肿瘤标志物的检测。/pp style="text-align: justify "　　FISH以标记的特异寡聚核苷酸片段作为探针，根据核酸碱基配对原理，将标记的探针与单链核酸片段配对，在荧光显微镜下观察目标序列的分布。FISH虽属于低通量检测，但目前已被用于检测肿瘤细胞[51]、突变染色体[52]、染色体重排[53]，在肿瘤生物标志物检测和个体化医疗方面具有重要意义。/pp style="text-align: justify "　　span style="color: rgb(0, 32, 96) "strong7、液体活检/strong/span/pp style="text-align: justify "　　液体活检是一种从血液等非实性样本中取样，用于诊断和检测肿瘤的方法。液体活检技术主要包括循环肿瘤细胞(circulating tumor cell， CTC)检测、循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)检测、外泌体检测等。与组织活检相比，液体活检能够早期筛查、检测肿瘤标志物，克服了肿瘤的时空异质性，具有无创、易反复取样、操作简便、可实时监控等优点，但同时也有价格昂贵、检测标准不统一等缺点。CTC检测目前主要使用的是免疫细胞化学方法，但CTC极低的丰度及其异质性使其面临着技术挑战。ctDNA检测主要采用分子生物学方法，但ct DNA具有易降解、含量低等缺点，为精准检测带来困难。外泌体检测在肿瘤诊断方面显示出良好的应用前景，是具有发展潜力的诊断方法，但其提取及操作尚无统一流程，检测系统有待进一步完善，以满足临床大规模样本检测的需要。检验医学网/pp style="text-align: justify "　　strong总结/strong/pp style="text-align: justify "　　肿瘤标志物作为临床上肿瘤辅助诊断、治疗参考以及预后判断的重要指标，目前在应用上愈发广泛，临床对检测技术的要求也不断发展。不仅有大量灵敏度或特异性更高的标志物被发现，而且在检测方法上也紧跟临床工作需求而不断发展。不同检测方法均有其优势与不足，如何对不同方法进行整合，提高肿瘤标志物的检出能力，是研究者们需关注和探索的问题。能够在肿瘤早期检出低含量肿瘤标志物，永远是临床肿瘤诊断的主要需求。不管使用何种材料，使用何种方法，提高检测的敏感性和特异性及稳定性永远是肿瘤标志物研发所追求的目标。/pp style="text-align: justify text-indent: 2em "strong参考文献/strong/pp　　[1]GERDTSSON A S, WINGREN C, PERSSON H, et al. 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7月12日，重庆日报记者了解到，在刚落下帷幕的第五届重庆市卫生健康系统“五小”创新赛中，来自重庆医科大学附属大学城医院（重庆医科大学第四临床学院）的表面等离子共振成像分析（SPRI）仪器（以下简称：SPRI仪器）项目团队获得一等奖。接下来，团队还将代表学校参加第九届中国国际“互联网+”大学生创新创业大赛重庆赛区选拔赛。“安装生物检测芯片、注入样本、按下加样按钮......”近日，在重庆市中医院，检验科医生申波正在用一台机器对病人的肿瘤标志物进行检测，30分钟后，检测结果就呈现在电脑屏幕上。“与以往传统的检测方法相比，这个‘大家伙’着实可以提高我们的检测效率和准确性。”申波感叹道。申波使用的正是SPRI仪器，该仪器可帮助医生对白血病、肺癌等多种肿瘤标志物进行早期检测。“目前，国内生产的用于检测肿瘤标志物的仪器采用的是第一代表面等离子共振（SPR）技术，它存在无法成像、检测通量低、应用范围窄等缺点，而最新的SPRI仪器依赖进口，不仅价格贵，还存在通量低、灵敏度欠佳等问题。”该项目学生团队负责人、重庆医科大学第四临床学院临床检验诊断学专业研究生郑霞介绍，对此，他们团队以医工结合的研发思路，以国际合作、校企合作、校内合作为依托，攻克了SPR成像检测体系构建、阵列化制作、玻璃可控蚀刻、真空镀膜等一系列技术难题，自主研发出国内首创的SPRI仪器，从而打破了国外垄断。项目指导老师重医附属大学城医院检验科主任薛建江介绍，该仪器首次解决了传统SPR技术无法成像这一技术问题；率先攻克了LED光源替代激光光源的世界级难题；可同时实现100余个样本的通量检测，灵敏度高于95%。“除了肿瘤标志物联合早筛外，该仪器有望在高血压药物筛选、污染物检测、新生儿遗传病基因筛查等方面开展应用。”目前，该SPRI仪器已获得重庆市医疗器械质量检验中心合格验证，形成了专利技术壁垒，并已在重庆市中医院、重大肿瘤医院对白血病和肺癌的肿瘤标志物检测进行临床试点。