跨膜细胞电阻仪原理

德国Nanoanalytics是一家专业从事表面、界面和微观分析领域材料表征的公司，他们拥有自己的研发团队和实验室，研发的产品具稳定性和创新力，并且在生命科学的微观检测领域中也有着很多核心产品。其中，实时无标记检测细胞跨膜电阻仪（cellZscope）自发明以来，便广受细胞屏障（消化道、呼吸道、血脑屏障）、药物转运、纳米药物研发、中枢神经系统疾病，肿瘤等领域研究者的认可，并助力用户在期刊中发表多篇学术论文（PNAS、Cell Rep.等），点击文末链接即可获取学术论文清单。cellZscope E型号仪器做为Nanoanalytics家族的一员，具有全自动实时动态检测跨膜电阻的功能、 6通道实时无标记测量，可兼容不同大小的transwell培养皿等特点，一经推出，即获得国内外客户的一致好评。对于通量要求不高的用户，它无疑是佳利器。在即将到来的2020年，也是Nanoanalytics成立20周年之际，该公司又将重磅推出一款“产品”：cellZscope 3型号仪器，并计划于春季正式发布。cellZscope 3除了Nanoanalytics产品线具有的常规优势外，还具有：★ 超高速测量(24孔的时间分辨率小于30秒)，★ 可将多四个细胞模块连接到一个控制器。★ 可完成平行测量96孔细胞样本。综合上述特点，新型号cellZscope 3型仪器，在屏障研究中，将大大提高研究样本的通量，尤其是在药物研发中，96孔通量可以进行一定程度的药物筛选，这也将进一步拓展cellZscope型号仪器的应用。 拓展应用：★ 细胞屏障（血脑屏障、鼻黏膜及消化道屏障等）的特性★ 紧密连接动力学★ 新型药物研发★ 药物或毒物对细胞屏障功能的影响★ 肿瘤侵袭转移★ 免疫细胞在中枢神经系统疾病中的作用论文清单1. NanoAnalyticCellZscope--发表文章列表：http://www.qd-china.com/productsColor.aspx?id=232&s=cellZscope

前文回顾：发明人库尔特的传奇人生——颗粒表征电阻法（上）一、经典库尔特原理在经典电阻法测量中，壁上带有一个小孔的玻璃管被放置在含有低浓度颗粒的弱电解质悬浮液中，该小孔使得管内外的液体相通，并通过一个在孔内另一个在孔外的两个电极建立一个电场。通常是在一片红宝石圆片上打上直径精确控制的小孔，然后将此圆片通过粘结或烧结贴在小孔管壁上有孔的位置。由于悬浮液中的电解质，在两电极加了一定电压后（或通了一定电流后）， 小孔内会有一定的电流流过（或两端有一定的电压），并在那小孔附近产生一个所谓的“感应区”。含颗粒的液体从小孔管外被真空或其他方法抽取而穿过小孔进入小孔管。当颗粒通过感应区时，颗粒的浸入体积取代了等同体积的电解液从而使感应区的电阻发生短暂的变化。这种电阻变化导致产生相应的电流脉冲或电压脉冲。图1 颗粒通过小孔时由于电阻变化而产生脉冲在测量血球细胞等生物颗粒时所用的电解质为生理盐水（0.9%氯化钠溶液），这也是人体内液体的渗透压浓度，红细胞可以在这个渗透压浓度中正常生存，浓度过低会发生红细胞的破裂，浓度过高会发生细胞的皱缩改变。在测量工业颗粒时，通常也用同样的电解质溶液，对粒度在小孔管测量下限附近的颗粒，用 4%的氯化钠溶液以增加测量灵敏度。当颗粒必须悬浮在有机溶剂内时，也可以加入适用于该有机溶液的电解质后，再用此有机 溶液内进行测量。通过测量电脉冲的数量及其振幅，可以获取有关颗粒数量和每个颗粒体积的信息。测量过程中检测到的脉冲数是测量到的颗粒数，脉冲的振幅与颗粒的体积成正比，从而可以获得颗粒粒度及其分布。由于每秒钟可测量多达 1 万个颗粒，整个测量通常在数分钟内可以完成。在使用已知粒度的标准物质进行校准后，颗粒体积测量的准确度通常在 1-2%以内。通过小孔的液体体积可以通过精确的计量装置来测量，这样就能从测量体积内的颗粒计数得到很准确的颗粒数量浓度。 为了能单独测量每个颗粒，悬浮液浓度必须能保证当含颗粒液体通过小孔时，颗粒是一个一个通过小孔，否则就会将两个颗粒计为一个，体积测量也会发生错误。由于浓度太高出现的重合效应会带来两种后果：1）两个颗粒被计为一个大颗粒；2）两个本来处于单个颗粒探测阈值之下而测不到的颗粒被计为一个大颗粒。颗粒通过小孔时可有不同的途径，可以径直地通过小孔，但也可能通过非轴向的途径通过。非轴向通过时不但速度会较慢，所受的电流密度也较大，结果会产生表观较大体积的后果，也有可能将一个颗粒计成两个[1]。现代商业仪器通过脉冲图形分析可以矫正由于非轴向流动对颗粒粒度测量或计数的影响。图2 颗粒的轴向流动与非轴向流动以及产生的脉冲经典库尔特原理的粒度测量下限由区分通过小孔的颗粒产生的信号与各种背景噪声的能力所决定。测量上限由在样品烧杯中均匀悬浮颗粒的能力决定。每个小孔可用于测量直径等于 2%至 80%小孔直径范围内的颗粒，即 40:1 的动态范围。实用中的小孔直径通常为 15 µm 至 2000 µm，所测颗粒粒度的范围为 0.3 µm 至 1600 µm。如果要测量的样品粒度分布范围比任何单个小孔所能测量的范围更宽，则可以使用两个或两个以上不同小孔直径的小孔管，将样品根据小孔的直径用湿法筛分或其他分离方法分级，以免大颗粒堵住小孔，然后将用不同小孔管分别测试得到的分布重叠起来，以提供完整的颗粒分布。譬如一个粒径分布为从 0.6 µm 至 240 µm 的样品，便可以用 30 µm、140 µm、400 µm 三根小孔管来进行测量。 库尔特原理的优点在于颗粒的体积与计数是每个颗粒单独测量的，所以有极高的分辨率，可以测量极稀或极少个数颗粒的样品。由于体积是直接测量而不是如激光衍射等技术的结果是通过某个模型计算出来的，所以不受模型与实际颗粒差别的影响，结果一般也不会因颗粒形状而产生偏差。该方法的最大局限是只能测量能悬浮在水相或非水相电解质溶液中的颗粒。使用当代微电子技术，测量中的每个脉冲过程都可以打上时间标记后详细记录下来用于回放或进行详细的脉冲图形分析。如果在测量过程中，颗粒有变化（如凝聚或溶解过程，细胞的生长或死亡过程等），则可以根据不同时间的脉冲对颗粒粒度进行动态跟踪。 对于球状或长短比很接近的非球状颗粒，脉冲类似于正弦波，波峰的两侧是对称的。对很长的棒状颗粒，如果是径直地通过小孔，则有可能当大部分进入感应区后，此颗粒还有部分在感应区外，这样产生的脉冲就是平台型的，从平台的宽度可以估计出棒的长度。对所有颗粒的脉冲图形进行分析，可以分辨出样品中的不同形状的颗粒。 大部分生物与工业颗粒是非导电与非多孔性的。对于含贯通孔或盲孔的颗粒，由于孔隙中填满了电解质溶液，在颗粒通过小孔时，这些体积并没有被非导电的颗粒物质所替代而对电脉冲有所贡献，所以电感应区法测量这些颗粒时，所测到的是颗粒的固体体积，其等效球直径将小于颗粒的包络等效球直径。对于孔隙率极高的如海绵状颗粒，测出的等效球直径可以比如用激光粒度仪测出的包络等效球小好几倍。 只要所加电场的电压不是太高，通常为 10 V 至 15 V，导电颗粒譬如金属颗粒也可以用电阻法进行测量，还可以添加 0.5%的溴棕三甲铵溶液阻止表面层的形成。当在一定电流获得结果后，可以使用一半的电流和两倍的增益重复进行分析，应该得到同样的结果。否则应使用更小的电流重复该过程，直到进一步降低电流时结果不变。 在各种制造过程中，例如在制造和使用化学机械抛光浆料、食品乳液、药品、油漆和印刷碳粉时，往往在产品的大量小颗粒中混有少量的聚合物或杂质大颗粒，这些大颗粒会严重影响产品质量，需要进行对其进行粒度与数量的表征。使用库尔特原理时，如果选择检测阈值远超过小颗粒粒度的小孔管（小孔直径比小颗粒大 50 倍以上），则可以含大量小颗粒的悬浮液作为基础液体，选择适当的仪器设置与直径在大颗粒平均直径的 1.2 倍至 50 倍左右的小孔，来检测那些平均直径比小颗粒至少大 5 倍的大颗粒 [2]。 二、库尔特原理的新发展 可调电阻脉冲感应法可调电阻脉冲感应法（TRPS）是在 21 世纪初发明的，用库尔特原理测量纳米颗粒的粒度与计数。在这一方法中，一个封闭的容器中间有一片弹性热塑性聚氨酯膜，膜上面有个小孔，小孔的大小（从 300 nm 至 15 m）可根据撑着膜的装置的拉伸而变来达到测量不同粒度的样品。与经典的电阻法仪器一样，在小孔两边各有一个电极，测量由于颗粒通过小孔而产生的电流（电压） 变化。它的主要应用是测量生物纳米颗粒如病毒，这类仪器不用真空抽取液体，而是用压力将携带颗粒的液体压过小孔。压力与电压都可调节以适用于不同的样 品。由于弹性膜的特性，此小孔很难做到均匀的圆形，大小也很难控制，每次测得的在一定压力、一定小孔直径下电脉冲高度与粒度的关系，需要通过测量标准颗粒来进行标定而确定。图3 可调电阻脉冲感应法示意图当小孔上有足够的压力差时，对流是主要的液体传输机制。 由于流体流速与施加的压力下降成正比，颗粒浓度可以从脉冲频率与施加压力之间线性关系的斜率求出。但是需要用已知浓度的标准颗粒在不同压力下进行标定以得到比例系数[3]。 这个技术在给定小孔直径的检测范围下限为能导致相对电流变化 0.05%的颗粒直径。检测范围的上限为小孔孔径的一半，这样能保持较低程度的小孔阻塞。典型的圆锥形小孔的动态范围 为 5:1 至 15:1，可测量的粒径范围通常从 40 nm 至 10 µm。 此技术也可在测量颗粒度的同时测量颗粒的 zeta 电位，但是测量的准确度与精确度都还有待提高，如何排除布朗运动对电泳迁移率测量的影响也是一个难题[4]。微型化的库尔特计数仪随着库尔特原理在生物领域与纳米材料领域不断扩展的应用，出现了好几类小型化（手提式）、微型化的库尔特计数仪。这些装置主要用于生物颗粒的检测与计数，粒度不是这些应用主要关心的参数，小孔的直径都在数百微米以内。与上述使用宏观压力的方法不同的是很多这些设计使用的是微流控技术，整个装置的核心部分就是一个微芯片，携带颗粒的液体在微通道中流动，小孔是微通道中的关卡。除了需要考虑液体微流对测量带来的影响，以及可以小至 10 nm 的微纳米级电极的生产及埋入，其余的测量原理和计算与经典的库尔特计数器并无两致。这些微芯片可以使用平版印刷、玻璃蚀刻、 防蚀层清除、面板覆盖等步骤用玻璃片制作[5]， 也可以使用三维打印的方式制作[6]。一些这类微流控电阻法装置已商业化。图4 微流计数仪示意图利用库尔特原理高精度快速的进行 DNA 测序近年来库尔特原理还被用于进行高精度、快速、检测误差极小的 DNA 或肽链测序。这个技术利用不同类型的纳米孔，如石墨烯形成的纳米孔或生物蛋白质分子的纳米孔，例如耻垢分枝杆菌孔蛋白 A（MspA）。当线性化的 DNA-肽复合物缓慢通过纳米孔时，由于不同碱基对所加电场中电流电压的响应不同，通过精确地测量电流的变化就可对肽链测序。由于此过程不影响肽链的完整性，如果将实验设计成由于电极极性的变化而肽链可以来 回反复地通过同一小孔，就可以反复地读取肽链中的碱基，在单氨基酸变异鉴定中的检测误差率可小于 10-6[7,8]。图5 纳米孔 DNA 测序库尔特原理的标准化 早在 2000 年，国际标准化组织就已成文了电感应区法测量颗粒分布的国际标准（ISO 13319），并得到了广泛引用。在 2007 年与 2021 年国际标准化组织又前后两次对此标准进行了修订。中国国家标委会也在 2013 年对此标准进行了采标，成为中国国家标准（GB/T 29025-2012）。参考文献【1】Berge, L.I., Jossang, T., Feder, J., Off-axis Response for Particles Passing through Long Apertures in Coulter-type Counters, Meas Sci Technol, 1990, 1(6), 471-474. 【2】Xu, R., Yang, Y., Method of Characterizing Particles, US Patent 8,395,398, 2013. 【3】Pei, Y., Vogel, R., Minelli, C., Tunable Resistive Pulse Sensing (TRPS), In Characterization of Nanoparticles, Measurement Processes for Nanoparticles, Eds. Hodoroaba, V., Unger, W.E.S., Shard, A.G., Elsevier, Amsterdam, 2020, Chpt.3.1.4, pp117-136.【4】Blundell, E.L.C.J, Vogel, R., Platt, M., Particle-by-Particle Charge Analysis of DNA-Modified Nanoparticles Using Tunable Resistive Pulse Sensing, Langmuir, 2016, 32(4), 1082–1090. 【5】Zhang, W., Hu, Y., Choi, G., Liang, S., Liu, M., Guan, W., Microfluidic Multiple Cross-Correlated Coulter Counter for Improved Particle Size Analysis, Sensor Actuat B: Chem, 2019, 296, 126615. 【6】Pollard, M., Hunsicker, E., Platt, M., A Tunable Three-Dimensional Printed Microfluidic Resistive Pulse Sensor for the Characterization of Algae and Microplastics, ACS Sens, 2020, 5(8), 2578–2586. 【7】Derrington, I.M., Butler, T.Z., Collins, M.D., Manrao, E., Pavlenok, M., Niederweis, M., Gundlach, J.H., Nanopore DNA sequencing with MspA, P Natl Acad Sci, 107(37), 16060-16065, 2010. 【8】Brinkerhoff, H., Kang, A.S.W., Liu, J., Aksimentiev, A., Dekker, C., Multiple Rereads of Single Proteins at Single– Amino Acid Resolution Using Nanopores, Science, 374(6574), 1509-1513, 2021. 作者简介许人良，国际标委会颗粒表征专家。1980年代前往美国就学，受教于20世纪物理化学大师彼得德拜的关门弟子、光散射巨擘朱鹏年和国际荧光物理化学权威魏尼克的门下，获博士及MBA学位。曾在多家跨国企业内任研发与管理等职位，包括美国贝克曼库尔特仪器公司颗粒部全球技术总监，英国马尔文仪器公司亚太区技术总监，美国麦克仪器公司中国区总经理，资深首席科学家。也曾任中国数所大学的兼职教授。 国际标准化组织资深专家与召集人，执笔与主持过多个颗粒表征国际标准 美国标准测试材料学会与化学学会的获奖者 中国颗粒学会高级理事，颗粒测试专业委员会常务理事 中国3个全国专业标准化技术委员会的委员 与中国颗粒学会共同主持设立了《麦克仪器-中国颗粒学报最佳论文奖》浸淫颗粒表征近半个世纪，除去70多篇专业学术论文、SCI援引近5000、数个美国专利之外，著有400页业内经典英文专著《Particle Characterization： Light Scattering Methods》，以及即将由化学工业出版社出版的《颗粒表征的光学技术及其应用》。点击图片查看更多表征技术

史上曾经有 400 多种颗粒表征技术，其中有一种以发明者命名的颗粒计数与粒度测试技术至今尚在广泛使用，并且是全球血细胞计数的标准技术，那就是被冠以科学名称电阻法（或电感应区法）的库尔特原理。此项技术自20 世纪 50 年代初发明以来[i]，被广泛应用于医学以及各个工业领域，包括超过 98%的自动细胞计数器[ii,iii]。除了测量各类血细胞外，此原理还可用于表征（计数和粒度测量）合适粒度范围内的任何可悬浮在电解质溶液中的颗粒材料[iv]。在过去 70 多年中，该方法已被用来表征数千种不同的医学与工业颗粒材料，2022 年的谷歌学者搜索发现有近 16 万篇有关库尔特计数器的各类文献。 在电阻法测量中，壁上带有一个小孔的玻璃管被放置在含有低浓度颗粒的弱电解质悬浮液中，该小孔使得管内外的液体相通，并通过一个在孔内另一个在孔外的两个电极建立一个电场。 由于悬浮液中的电解质，在两电极加了一定电压后（或通了一定电流后），小孔内会有一定的电流流过（或两端有一定的电压），并在那小孔附近产生一个所谓的“感应区”。含颗粒的液体从小孔管外被真空或其他方法抽取而穿过小孔进入小孔管。当颗粒通过感应区时，颗粒的浸入体积取代了等同体积的电解液从而使感应区的电阻发生短暂的变化。这种电阻变化导致产生相应的电流脉冲或电压脉冲。通过测量电脉冲的数量及其振幅，可以获取有关颗粒数量和每个颗粒体积的信息。 1 库尔特原理示意图 本文将分为两篇。第一篇介绍库尔特先生，第二篇介绍经典库尔特原理及其最新发展。库尔特先生&库尔特原理库尔特先生是与中美两国有密切关系的一位传奇性人物。2 华莱士• 库尔特（Wallace H. Coulter，1913-1998）他出生于阿肯色州，在乔治亚理工学院学习电子工程。1930 年代，他是美国通用电气公司在中国的销售代理，住在上海和平饭店。 正当他处于热恋之中，与一位白俄罗斯美女在和平饭店品着美酒咖啡，欣赏爵士音乐，漫步月光下的外滩时，太平洋战争爆发，日军侵入了上海的公共租界。他不得不离开恋人，随着日军的不断南侵，从华南经东南亚回到美国。中美 1979 年建交后，他成为最初一批前往中国访问的美商。他与随行人员回到和平饭店那间包房，抚摸着外滩的岸墙，勾起了深深的回忆。他期望在中国政府的帮助下，寻找那在战乱中失联的情人。30多年的动荡岁月，又是一位外籍女子，那是一个达不成的愿望。他钟情一生，终身未婚，也无子女，可是中国情结却挥之不去。 3 库尔特在 1990 年代与中国代表团，右一为作者。早在 1970 年代，库尔特公司就由其英国分公司在华销售血细胞计数仪。中美建交之后的 1980 年代，库尔特公司在蔡光天开办的改革开放早期最大的英语培训学校——上海前进业余进修学校的帮助下，成为最早一批在中国开展业务的美国企业。他办公室内，桌上地下放满了与中国有关的书籍物品，每次有来自中国的访客或员工，他都会亲切地与他们会面，亲自解释库尔特原理。1940 年代，美国在日本投了原子弹后，受辐射区人们需要进行大量的血液检验，但当时的医学界缺乏快速准确的血细胞检验方法。库尔特在自家车库内埋头研究了数年。最初的设计是在一张纸上打一个粗糙的洞，然后将纸浸在液体中。经过无数次的试验与设计改动，并据说他曾经割破自己的手指滴血，来验证他的发明。库尔特最终在 1953 年发明了被世人普遍认可的库尔特原理，并为之成立了库尔特电子公司（Coulter Electronics），量产血液计数仪，给全球血液检验带来了革命性的飞跃。库尔特公司在佛罗里达州全盛时有四五千员工。 库尔特并直接促成了颗粒表征业内另外两家公司的成立与发展。他的一个员工伯格 （Rebert H. Berg, 1921-1999）考虑到工业界颗粒大小的分布一般较宽，线性电子线路无法满足， 发明了对数安排的电子线路，可以测量粒径跨越几个数量级的样品。伯格后来在 1958 年成立了规模较小的颗粒数据实验室（Particle Data Laboratories），在工业界推广库尔特计数仪。而当库尔特母校乔治亚理工学院的奥尔教授（Clyde Orr,1921-2010）与他的博士生亨德里克斯（Warren P. Hendrix,1932-2005）在 1962 年下海生产全球首款商用表面吸附仪时，已在商业上小有成就的库尔特出资促成了麦克仪器公司（Micromeritics Instrument Company）的成立。而麦克仪器公司又在 1997 年收购了由于伯格陷入尼日利亚骗局而濒临破产的公司的库尔特计数仪产品。 4 收藏在美国历史国家博物馆中最早的库尔特计数仪：型号 A当库尔特自知来日不多时， 他想起了老朋友贝克曼（Arnold O. Beckman，1900-2004）。尽管贝克曼早已退休，可是贝克曼仪器公司的文化传承很使库尔特满意，他拒绝了数家更大公司的高价，在贝克曼仪器公司保证保留他姓的条件下，在 1997 年促成了贝克曼库尔特公司的诞生。 他将出售公司获得的款项，建立了有近 5 亿美金的华莱士·H·库尔特基金，专用于通过医学与工程研究而发展医疗保健。库尔特并被美国科学历史研究所列入了名人堂。参考文献【i】 Coulter, W.H., Means for Counting Particles Suspended in a Fluid, US Patent 2,656,508, 1953. 【ii】Graham, M.D., The Coulter Principle: Foundation of an Industry, J Assoc Lab Auto, 2003, 8(6), 72-81. 【iii】 Graham M.D., The Coulter Principle: Imaginary Origins, Cytometry A, 2013, 83(12), 1057-61. 【iv】 Lines, R.W., The Electrical Sensing Zone Method, in Liquid and Surface-Borne Particle Measurement Handbook, Eds. Knapp, J.Z., Barber, T.A., Lieberman, A., Marcel Dekker, New York, 1996, Chpt.4, pp113-154. 作者简介许人良，国际标委会颗粒表征专家。1980年代前往美国就学，受教于20世纪物理化学大师彼得德拜的关门弟子、光散射巨擘朱鹏年和国际荧光物理化学权威魏尼克的门下，获博士及MBA学位。曾在多家跨国企业内任研发与管理等职位，包括美国贝克曼库尔特仪器公司颗粒部全球技术总监，英国马尔文仪器公司亚太区技术总监，美国麦克仪器公司中国区总经理，资深首席科学家。也曾任中国数所大学的兼职教授。 国际标准化组织资深专家与召集人，执笔与主持过多个颗粒表征国际标准 美国标准测试材料学会与化学学会的获奖者 中国颗粒学会高级理事，颗粒测试专业委员会常务理事 中国3个全国专业标准化技术委员会的委员 与中国颗粒学会共同主持设立了《麦克仪器-中国颗粒学报最佳论文奖》浸淫颗粒表征近半个世纪，除去70多篇专业学术论文、SCI援引近5000、数个美国专利之外，著有400页业内经典英文专著《Particle Characterization： Light Scattering Methods》，以及即将由化学工业出版社出版的《颗粒表征的光学技术及其应用》。点击图片查看更多表征技术