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[align=center][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]新型[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=18px][color=#000000]外泌体分离方法[/color][/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=16px]肿瘤细胞来源的外泌体在分子水平上促进肿瘤的进展、侵袭和转移。因此,在探索细胞间信号传导,分析功能分子成分(蛋白质、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]mRNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]microRNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])前需要有效的检测和分离肿瘤源性外泌体的能力,这可能为癌症诊断和预后提供关键信息。[/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][color=#000000]1[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]基于尺寸排阻的外泌体分离技术[/color][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=16px]外泌体是直径在[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]30-200 nm[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的囊泡,其尺寸小于绝大部分的细胞外囊泡,因此,基于这一特性,可利用具有限制相对分子量或大小的过滤器来分离外泌体。目前,最常用的基于尺寸的外泌体分离技术就是超滤离心法。该方法是一种基于悬浮颗粒或聚合物大小的外泌体分离技术,小于膜孔径的物质会通过过滤膜,大于膜孔径的物质被截留在膜上。超滤法比[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]UC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]速度更快,且不需要特殊的设备,已有研究表明该方法可以成功从[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]0.5 mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]尿液中分离外泌体。[/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px]目前已经开发了一种适合无细胞样品的商用外泌体分离试剂盒,兼具外泌体分离和[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]RNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]提取的功能。如图所示,该试剂盒利用注射过滤器双层膜结构,当样品通过两层膜时,较大的细胞外囊泡(如凋亡小体和微囊泡)被保留在上层膜上,而外泌体捕获在下层膜上。与[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]UC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]和外泌体沉淀法相比,超滤法从尿液中获得的外泌体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]RNA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]产量最高。该方法的主要缺点在于分离的外泌体容易堵塞过滤膜,导致分离效率下降。此外,该方法可能会导致囊泡的变形和破裂,影响下游分析的结果。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]另一种基于尺寸的外泌体分离方法是尺寸排除色谱法[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]([/size][/font][font='times new roman'][size=16px]SEC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。该方法利用多孔固定相将悬浮颗粒和聚合物按照大小进行分类[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]流体动力半径小的物质能够通过孔隙,而流体动力半径较大的物质会被截留在孔隙上。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]此外,[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]该方法结合其他方法使用可取得更好的效果[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]。[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]例如,与单纯的超滤法或[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]UC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]相比,该方法分离的外泌体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]结合[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]后续超速离心可以[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]提高[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]尿外泌体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的捕获效率[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],从而有利于寻找肾脏疾病生物标志物。该方法分离外泌体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]主要[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]缺点在于干扰物多[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]孔隙极易堵塞,导致色谱柱重复率低,分离效率较低。[/size][/font][align=left][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108012209419773_3887_5111497_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman']图[/font][font='times new roman']1-3[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']连续过滤原理图[/font][font='times new roman'][size=13px][68][/size][/font][/align][align=center][font='times new roman']Figure [/font][font='times new roman']1-[/font][font='times new roman']3[/font][font='times new roman'] [/font][font='times new roman']Schematic illustration of sequential filtration[/font][font='times new roman'][size=13px][68][/size][/font][/align][align=center][/align][font='times new roman'][color=#000000]2[/color][/font][font='times new roman'][color=#000000]基于聚合物沉淀的分离技术[/color][/font][font='times new roman'][size=16px]聚合物沉淀[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]技术是通过添加水性聚合物使外泌体溶解度或分散性改变,减少外泌体的水合作用,使外泌体沉淀以达到分离的技术。通常使用分子量为[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]8000 Da[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的聚乙二醇([/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PEG[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])与样品共孵育,[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]4[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]℃过夜后,用低速离心或过滤法分离含有外泌体的沉淀物。目前,已开发了一系列聚合物沉淀试剂盒可用于体液和培养基中外泌体的分离。聚合物沉淀分离外泌体的方法易于使用、回收率高,且不需要专门的设备。该方法的主要缺点在于容易引入蛋白质和聚合物材料等其他污染物,使得提取的外泌体纯度较低。[/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000000]3[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000000] [/color][/size][/font][font='times new roman'][size=14px][color=#000000]基于免疫亲和的分离技术[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]外泌体磷脂双层膜中含有丰富的蛋白质和受体,如[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]CD81[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]CD63[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]TSG101[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]、上皮细胞粘附分子等,利用这些受体与配体之间的相互作用,使外泌体与特殊设计的磁性颗粒之间建立免疫亲和作用,可用于外泌体的分离富集。例如,[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]Zarovni[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]等报道了一种基于微孔板的酶联免疫吸附试验([/size][/font][font='times new roman'][size=16px]ELISA[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])用于捕获和定量检测外泌体。尽管与[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]UC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]产量相当,但是该方法具有快速、易于使用和与常规设备兼容的优势。该报道继续开发了一种基于磁免疫捕获的外泌体分离试剂盒用于从细胞培养基和生物液中分离外泌体,其质量和纯度均优于其他技术。此外,这种方法对样品的初始体积没有要求,可以很容易地缩小或增大样品容量。而该技术主要缺点在于缺乏最佳的外泌体标志物。此外,随着肿瘤的进展,肿瘤抗原表达和调节的异质性可能导致低估和假阴性,并且有些抗原表位可能被阻断或掩蔽。[/size][/font]
大家好,新手科研小白,想求助大家SEC分离外泌体需要采购的仪器有哪些,暂定是用血清外泌体
[font='times new roman'][size=18px][color=#000000]基于超速离心的外泌体分离技术[/color][/size][/font][align=left][font='times new roman'][size=16px]超速离心法([/size][/font][font='times new roman'][size=16px]UC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])是目前外泌体分离的“金标准”,大约[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]56%[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的实验人员使用这种技术分离外泌体。目前[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]UC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]包括差速超速离心和密度梯度超速离心。差速超速离心分离外泌体的方法主要受颗粒的大小、密度和形状的影响,基于颗粒的沉降速率不同,通过施加离心力,样品可以根据它们的物理性质被分离。在相同的颗粒密度下,大颗粒的沉积速度比小颗粒快,因此,更小的颗粒,如外泌体,可以通过一系列连续增加的旋转速度分离出来,具体步骤如图所示。首先用[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]300 g[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]2000 g[/size][/font][font='times new roman'][size=16px],[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]10000 g[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]的转速分别去除培养基中的细胞、坏死细胞和细胞碎片,上清液继续进行[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]100,000 g 70[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]分钟的超速离心,沉淀部分重悬在磷酸盐([/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PBS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])缓冲液中进行另一轮[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]100,000 g[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]超速离心,最后,将得到的外泌体重悬于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]PBS[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]缓冲液中以作下一步分析。[/size][/font][/align][align=left][font='times new roman'][size=16px]密度梯度离心[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]法将待测生物样品添加到自上而下密度逐步增大的溶液中,在超速离心之后,这些外泌体就会移动到对应密度梯度层的底部(外泌体的密度介于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]1.10-1.21 g/mL[/size][/font][font='times new roman'][size=16px])。密度梯度离心法获得的外泌体具有更好的完整性和生物活性。此外,由于[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]外泌体[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]与胞外囊泡的大小存在重叠且外泌体存在异质性,差速超速离心分离得到的外泌体纯度和效率均较低,而密度梯度离心法使密度相对较低的外泌体漂浮,进一步净化了外泌体。[/size][/font][/align][font='times new roman'][size=16px]虽然[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]UC[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]是目前最常用的方法,但它也存在一些缺点:它是一种劳动密集型、耗时的方法(通常持续[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]5-10 h[/size][/font][font='times new roman'][size=16px]),需要大量的样品和昂贵的专用设备。聚集的蛋白质和核蛋白颗粒污染使得分离的外泌体的效率和纯度相对较低。此[/size][/font][font='times new roman'][size=16px][color=#000000]外,[/color][/size][/font][font='times new roman'][size=16px]分离过程中需要超高的离心力,这可能会导致外泌体的形态和组成发生变化。[/size][/font][align=center][img]https://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2021/08/202108012208553147_7986_5111497_3.png[/img][/align][align=center][font='times new roman']图[/font][font='times new roman'] 1 [/font][font='times new roman']用差速超离心法分离外泌体示意图[/font][/align]