快速冷冻显微镜

在过去的二十年中，冷冻显微镜方法已经成为生命科学家、制药研究人员等广泛使用的有效工具，用于检查接近其原生状态的生物结构1。冷冻显微镜能够可视化蛋白质和蛋白质复合物等物质的生物分子结构，是对现有的方法如x射线晶体学和核磁共振(NMR)等的有价值的补充。确定蛋白质和蛋白质复合物的结构是药物发现的一个重要部分，这对研究药物靶点非常有意义，也是深入了解疾病机制的重要课题。在这篇文章中，我们将阐述冷冻显微镜技术的使用，包括冷冻光学电子显微镜(cryo-CLEM)，冷冻干燥显微镜(FDM)，药物研究中的低温保存，以及温度控制显微镜如何使研究人员能够在低温下推进药物发现和开发研究。冷冻光学电子显微镜（Cryo-CLEM）电子显微镜(EM)使用微量材料，具备接近原子的分辨率，可以研究不同功能状态下的分子。冷冻电镜（Cryo-EM）使用极低温度，克服了真空条件下使用电子束测量高含水量生物标本的难题。在20世纪80年代冷冻电镜商业化之前，生物标本是通过化学固定或染色等方法制备的，但这些方法存在保存伪影，会影响图像分辨率。快速冷冻通常用于将样品保持在与自然生理环境相似的冷冻状态，在临床前阶段取得的结果必须在临床研究中可复制，这在药物研究中尤其重要。Cryo-CLEM结合低温荧光技术和冷冻电镜技术，提高了活检细胞内生物、化学和遗传过程的灵敏度。Cryo-CLEM能够对冷冻固定样品中的分子或分子组件(如细胞内膜、DNA或细胞结构元件)进行直接荧光标记和靶向，精确定位区域，以便后续使用EM进行高分辨率成像。为了使生物样品与EM中发现的真空条件兼容并保存结构细节，样品被嵌入玻璃状的冰中，需要保持在-140°C以下。必须避免与空气中水分接触，因为一旦接触会形成冰晶并污染样品。在低温条件下，荧光信号的结构细节被保留，光漂白显著减少。冷冻光学电子显微镜技术的进步体现在它包含了创新的冷冻荧光级，如Linkam CMS196，它能够自动获取整个电镜网格的高分辨率荧光图。这也用于样品导航，并将cryo-CLEM的案例情况与EM或与x射线显微镜等其他技术相关联。西班牙巴塞罗那的一组研究人员和临床医生使用荧光显微镜、透射电子显微镜(TEM)和低温软x射线断层扫描(cryo-SXT)，可以观察到抗癌药物顺铂在极低浓度下的有效性，确定产生效果所需的最低剂量，以最大限度地降低毒性2。该小组在荧光显微镜上对低温冷冻的细胞样本进行成像，使用CMS196冷冻荧光台在液氮温度下将它们玻璃化，然后使用cryo-SXT对样本进行分析，这使得在纳米尺度上进行3D研究成为可能。得益于现有的低温成像技术，研究结果表明，三甲碱(研究的两种佐剂之一)促进了顺铂在较低剂量下的有效治疗，这可能为化疗治疗的发展铺平了道路，减少了对患者的副作用。冻干显微镜许多药物生产为冻干或冻干配方，以增加稳定性和延长保质期。药物开发人员必须为新的药物化合物创建一个优化的冷冻干燥过程，这可能是一项复杂而昂贵的工作。为了简化流程和开发更高效的冷冻干燥循环，了解三个主要冷冻干燥步骤的温度和压力要求是很重要的。使用冷冻干燥显微镜(FDM)，研究人员可以直接可视化每个步骤，并确定药物产品在不同热条件下的行为。FDM包括一个专用的光学显微镜和一个专用的热工作台，它可以准确地控制样品的温度和压力，并允许实时进行热测量。冷冻干燥的一个关键参数是塌陷温度(Tc)，即产品失去结构完整性并导致加工缺陷的温度。FDM使药物开发人员能够密切监测样品并快速有效地调整冷冻干燥方案。英国国家生物标准与控制研究所(NIBSC)的一个研究小组正在利用先进的FDM技术研究冷冻干燥药物的复杂性。该小组由Paul Matejtschuk博士领导，正专注于研究优化冻干脂质体药物的配方。由于冻干脂质体药物物理和化学性质不稳定，这对开发提出了挑战。Matejtschuk博士和他的团队使用安装在光学显微镜上的专用冷冻台(FDCS196, Linkam科学仪器)(图1)，通过估计冻结、塌陷和融化温度，预测脂质体-冷冻保护剂混合物的理想的冷冻干燥条件3。图1:NIBSC实验室的仪器配置。Linkam FDCS196冷冻干燥冷冻台，T94控制器和液氮泵，真空泵，奥林巴斯BX51光学显微镜。图像显示FDM系统的旧版本图2: Linkam FDCS196冻干显微镜系统的最新版本这样的实验对于继续努力开发快速、可转移和可扩展的冷冻干燥方法来稳定脂质体等药物化合物至关重要。低温贮藏储存用于研究的生物标本有赖于有效的保存技术，以保持细胞的物理和生物完整性。冷冻或冷冻样品可能会导致冰晶的积聚，导致终端细胞损伤。冷冻保护剂是在冷冻过程中通过降低水的熔点来防止细胞损伤的重要物质。许多生物，如极地昆虫、鱼类和两栖动物，会产生自己的冷冻保护剂或防冻化合物。科学家们正在研究这些化合物，以开发新的冷冻保护剂来保存研究用的细胞。例如，由Matthew Gibson博士领导的英国华威大学的研究人员，正在研究防冻剂(糖)蛋白(AFP)，目的是开发新的合成AFP模拟化合物。该实验室使用低温生物学工作台(BCS196，Linkam Scientific Instruments)来测量细胞中的冰晶生长，依靠该仪器的温度控制能力来观察AFP。Gibson博士研究了使用金纳米颗粒作为探针来测量冰再结晶抑制活性现象，使用低温生物学工作台来改变温度，并开发出一种高通量方法来筛选类似AFP具有结构特征的材料。4诸如此类的发现为开发新型冷冻保护剂提供了潜力，这种保护剂可以防止冷冻保存细胞中冰的生长，从而保持细胞的完整性，因此在生物医学和药学研究中具有潜在用途。未来药物研究本文中描述的技术强调了目前已有的各种冷冻显微镜方法的选择，这些方法有助于推进药物研究。Cryo-CLEM结合了cryo-EM和低温荧光的力量，作为一种相对较新的技术，它的成功依赖于专用冷冻工作台的发展，从而促进了Cryo-CLEM工作流程。这种工作台能够在液氮温度下保持玻璃化样品，使它们在从荧光显微镜移动到冷冻电镜成像时保持无污染。其他专用的冷冻台可与广泛的显微镜技术兼容，如FDM，可在成像过程中精确控制样品的温度，低至-196°C。这些创新为制药研究人员新疗法和生产工艺评估，以及生物样本保存以供未来研究等大量应用提供了工具。 作者：Linkam Scientific Instruments销售及市场部经理Clara Ko参考文献：1. Booy, F. and Orlova, E.V. Cryomicroscopy, in: Chemical Biology: Applications and Techniques (eds Larijani, B., Rosser, C.A., and Woscholski, R.) 2007.2. Gil, S., Solano, E., Martinez-Trucharte, F., et al. Multiparametric analysis of the3. effectiveness of cisplatin on cutaneous squamous carcinoma cells using two different types of adjuvants. PLoS ONE. 2020 15(3): e0230022.4. Hussain M.T., Forbes N., Perrie Y., Malik K.P., Duru C. and Matejtschuk P. Freeze-drying cycle optimization for the rapid preservation of protein-loaded liposomal formulations. International Journal of Pharmaceutics 573, 2020 118722.5. Mitchell, D. E., Congdon, T., Rodger, A., and Gibson, M. I. Gold Nanoparticle Aggregation as a Probe of Antifreeze (Glyco) Protein-Inspired Ice Recrystallization Inhibition and Identification of New IRI Active Macromolecules. Scientific Reports, 2015 5: 15716.

冷冻TEM薄片制备和冷冻体积成像的全新工作流程解决方案 蔡司冷冻关联工作流程联接了光学显微镜和双束电镜(FIB-SEM)，从而用于分析细胞的超微结构随着蔡司冷冻关联工作流程的发布，蔡司为生命科学研究团体提供了一种新的软硬件结合的冷冻显微镜解决方案。该工作流程将宽场显微镜、共聚焦显微镜和双束电镜(FIB-SEM)无缝地连接起来，且便于使用。该解决方案提供了针对冷冻关联工作流程需求而优化的硬件和软件，从荧光大分子的定位到高衬度体积成像和用于冷冻电子断层成像的薄片减薄。冷冻关联显微镜技术是一种新兴的大分子结构分析技术。由于细胞和组织的超微结构可以不带人为假象的保存下来，因此冷冻显微镜可以在接近自然的状态下观察细胞结构。然而，这项技术却给用户带来了复杂的挑战，例如耗时的样品制备和成像流程、去玻璃化、冰晶污染或样品丢失。“在蔡司，我们通常致力于确保研究人员能够更快地采集数据，更好地分析数据。借助蔡司的冷冻关联工作流程，我们正朝着简化和优化科学家的工作流程的方向迈出下一步，以便他们能够完全专注于自己的研究。” 蔡司研究显微镜解决方案负责人Michael Albiez博士强调道。各种研究领域，如细胞生物学、癌症研究、植物科学和发育生物学，都将受益于冷冻显微镜获得的超微结构信息。蔡司冷冻关联工作流程帮助研究人员更容易获得这一先进技术，使他们能够更快地评估样品的质量，获得高分辨率、高衬度的3D数据流，并简化TEM薄片制备的工作流程。简化的工作流程和样本的安全传输蔡司冷冻关联工作流程联接宽场显微镜或共聚焦显微镜（蔡司Axio Imager、蔡司LSM 900/980 with Airyscan）和双束电镜（蔡司Crossbeam），以实现体积成像和TEM薄片的高效制备。专用的配件简化了工作流程，并有助于在显微镜之间安全的转移玻璃化样品。这些部件与冷冻关联显微镜样品台台Linkam CMS196V³和冷冻传输系统Quorum PP3010Z兼容。数据管理由蔡司联用软件ZEN Connect负责。这一系列的工具都有助于增强成像效果。最高的成像性能贯穿全工作流程得益于适用于冷冻成像的物镜和蔡司Airyscan探测器的高灵敏度，蔡司共聚焦显微系统能够以高分辨率探测和定位蛋白质和细胞结构，同时温和的光照可以防止样品去玻璃化。蔡司双束电镜Crossbeam提供了高衬度体积成像-甚至样品没有经过重金属染色。这两种方式为彻底了解超微结构提供了有价值的功能和结构信息。在室温下使用可提高工作效率不同于其他解决方案，该工作流程中使用的蔡司显微镜不仅可用于冷冻显微镜技术，也可用于室温的应用。将设备从冷冻状态转换为室温状态非常快速且无需专业技术。这种灵活性为用户提供了更多的实验时间。成像平台可以从更高的利用率和更快的投资回报中受益。

近日，江北新区冷冻透射电子显微镜政府采购项目在江北新区公共资源交易分中心顺利完成开评标。本次采购物品为一台300KV冷冻透射电子显微镜，采用公开招标方式组织采购。此项目的顺利开展标志着江苏省内首台进口冷冻透射电子显微镜即将配备到位，该设备将进一步服务于江苏省生物医药科研及生产领域的结构生物学平台。由于生物医药研发需求的快速增加，国内对高端先进设备的需求与日俱增，作为当前结构生物学领域最为前沿的成像技术之一，冷冻透射电子显微镜技术于2017年荣诺贝尔化学奖，这一最新技术使得显微镜的观测等级从纳米级上升到原子级别的生命结构。由于江苏省内尚无公共科研机构或平台能够向科研院所和生物医药企业提供该项服务，且能够满足当前最新科研需求的该类设备在中国境内无法获取，这在一定程度上限制了地区生物医药领域的研发水平，因此购置江苏省第一台高分辨率冷冻电镜的任务提上日程。南京大学人工智能生物医药技术研究院作为采购人主体单位，经前期政府采购进口产品相关行业主管部门批准及专家论证，委托江北新区公共资源交易分中心组织该项采购。因项目性质特殊，涉及大量专业技术参数要求，且采购人为首次接触集中采购业务，因此在提供采购需求和编制采购文件阶段，为合理设置需求、完善文件结构、加快项目进程，江北新区公共资源交易分中心安排专人对接，详细说明采购流程，介绍交易系统功能模块设置和具体操作要求，与此同时针对需求细节讲解政采法规及政策条文规定。经与采购人间的多轮沟通，该项目于2023年5月8日发布采购公告。5月29日，项目如期开标，经过评标委员会紧张有序、全面细致的现场评审，最终捷欧路（北京）科贸有限公司中标，后续其将为采购人提供相应产品及服务，“中心也将持续关注相关标后事宜。”相关工作人员表示。