对抗病毒,微孔板检测和成像能够开展哪些工作?
2020年注定是不平凡的一年,而在每个平凡工作岗位上的我们,总希望能在这个特殊的时期做点什么,哪怕微小的贡献,汇集在一起,一定会成为改变的推动力。所以,小编梳理了一下在抗病毒药物、疫苗研发生产等相关领域的工作中,我们的微孔板检测及成像设备能够开展的实验和项目,希望能够对在攻坚岗位上奋斗的老师们有所帮助。病毒,可以是恶魔,也可以是工具我们都知道,病毒(virus)由一种核酸分子(dna或rna)与蛋白质(protein)构成或仅由蛋白质构成(如朊病毒)的有机形态,它介于生命与非生命之间,超然在五界之外(传统的五界分类法)。这样一种看起来无比“简单而低级”的东西,却在人类历史上留下持续至今挥之不去的阴影,比如ebola,比如hiv,比如,现在全国上下一心对抗的新冠病毒。但是,拥有高级智慧的人类,怎会轻易被这些简单而低级的玩意儿打败?所以,我们有了疫苗,有了抗病毒药物,聪明的人类还利用病毒感染宿主细胞进行自我复制的机制,把恶魔变成工具,应用到人类的生产生活中,比如通过病毒进行花卉育种,利用病毒作为载体进行生物研究、基因治疗等等。所以今天,我们首先分享一些围绕抗病毒药物研发、疫苗生产等相关领域,微孔板检测和成像设备的应用方向,后续我们会为大家继续分享微孔板相关设备在如何“利用”病毒开展生物研究工作。病毒的数量与感染性测定病毒感染哺乳动物细胞后,除了通过rt-pcr的方法,可以通过细胞病变效应、红细胞吸附和免疫标记检查法等评价病毒在细胞中的增殖情况。细胞病变效应(cytopathic effect, cpe),是指病毒在敏感细胞内增殖引起的光镜下可见的细胞病理改变。大多数动物病毒感染敏感细胞培养都能引起其显微表现改变,例如细胞聚集成团肿大圆缩脱落及细胞融合成为多核细胞,细胞内出现包涵体(inclusion body),乃至细胞裂解等,正是因为cpe的表现,我们可以在体外细胞水平评价病毒感染宿主细胞的情况。病毒毒价测定是病毒学相关研究中最基本的技术手段,无论疫苗研发、抗病毒药物评估或者是病毒重组载体构建,均需要在不同环节评定病毒毒价,而目前主要方法包括蚀斑实验、tcid50测定和免疫染色法等。病毒蚀斑实验病毒蚀斑是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。方法:将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中。病毒吸附后,再覆盖一层融化的半固体营养琼脂,使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶。用活性染料 (如中性红) 染色,则活细胞着色,受病毒感染而破坏的细胞不着色,形成肉眼可见的蚀斑(plaque)。每个蚀斑是由一个感染性病毒颗粒形成的,称作蚀斑形成单位 (plaque forming unit,pfu)。通常以每毫升病毒液的空斑形成单位既 pfu/ml表示。上图来自武汉大学基础医学院,病毒感染6孔板细胞后形成空斑病灶,使用中性红染色后,通过cytation的4x物镜明场模式对全孔进行拼接成像,软件分析识别孔中的空斑病灶个数。tcid50法tcid50法是测定病毒能使50%的组织培养细胞发生感染的最小量。方法:一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释,分别接种细胞,经一定时间后观察cpe、血细胞吸附等指标,以最高稀释度能感染50%细胞的量为终点。最后用统计方法(reed muench法)计算出50%组织细胞感染量( 50%tissue culture infectious dose,tcid50)。免疫染色法空斑实验法或常规tcid50测定滴度依赖于病毒在感染细胞中的复制以及感染周边细胞形成局灶型病变;而免疫染色法只需要病毒感染靶细胞并表达病毒所编码的蛋白。因此,免疫染色法(infectious units per ml, or ifu/ml)测定病毒滴度需要的时间比空斑法(pfu/ml)更短。其中,免疫染色法包括hrp组化或免疫荧光染色等。同样类型方法也适用于表达荧光报告基因的重组病毒的毒价测定。例如,以针对杆状病毒囊膜蛋白gp64的单克隆抗体标记被病毒感染的细胞,然后以hrp-标记的二抗与感染细胞进行染色。通过底物显色,在光学显微镜下计数感染斑点的数量,经过稀释倍数的换算,即可得出病毒的滴度(ifu/ml)。输问题:无论是plaque assays还是tcid50,均涉及较多微孔的细胞计数或阴/阳性孔判断,常规的显微镜观测法,操作不便且对研究者伤害较大。因此biotek为大家提供了更加自动化的解决方法:通过cytation/lionheartfx自动化成像设备进行cpe或者plaque的成像及计数。上图:cytation5自动化成像系统支持明场、彩色明场、荧光场等模式自动化成像检测,并且可选择大视野成像模式,4倍镜一个视野可覆盖384孔板整孔,提高全孔、整板成像的检测速度。上图:两种病毒感染细胞后,通过红色/绿色荧光探针标记的抗体进行免疫荧光染色,采用cytation双荧光通道自动成像,并对病毒感染的细胞病灶进行识别成像。抗病毒药物筛选相关应用