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科学家观察到酶是如何“编辑”DNA的 有望用以纠正人类遗传疾病 科技日报讯 (记者陈丹)一个国际研究小组在了解酶如何“编辑”基因方面取得了重要进展:观察到了一类被称为CRISPR的酶绑定并改变DNA(脱氧核糖核酸)结构的过程。这项发表于5月27日(北京时间)美国《国家科学院学报》上的研究成果有望为纠正人类的遗传疾病铺平道路。 CRISPR意即“成簇的规律间隔的短回文重复”,在上世纪80年代才首次为人们所认知。到目前为止,已发现40%已测序细菌和90%已测序古细菌的基因组存在这种重复序列,而且细菌已开发出一套可以探测和切断外来DNA的免疫策略。其机理大致如此:CRISPR序列与很多病毒、噬菌体或者质粒的DNA序列同源,受到攻击的细菌会以相匹配的DNA为目标进行自然防御。它们所采用的手段,就是利用一种名为Cas9的内切酶,裂解外来DNA。 基因工程师们意识到,如果将细菌的CRISPR-Cas9系统插入其它生物体细胞,它们也能够对目标DNA进行切割。就在去年,这一革命性的基因编辑技术收获了一系列成果:多个研究团队已经成功对人体、小鼠、斑马鱼、大米、小麦等细胞中的基因进行删除、添加、激活或抑制等操作,从而证明该技术的广泛适用性。 不过,人类基因组有30亿个碱基对,要准确锁定某个目标DNA,工作量大致相当于从一套23卷的《百科全书》中找出一个拼错的单词。因此,研究人员为Cas9这把“基因剪刀”找了一个与目标基因匹配的RNA(核糖核酸)作为“导航仪”。在这个靶向过程中,Cas9拉开DNA链,并插入RNA,使之形成了一个被称为R环的特定序列结构。 在最新研究中,英国布里斯托尔大学和立陶宛生物技术研究所的科学家使用经过特别改装的显微镜对R环模型进行了检测。显微镜下的单个DNA分子被磁场拉伸着,通过改变DNA受到的扭力,他们能够直接观测由单个CRISPR酶介导R环形成的过程。这使得这个过程中以前不为人知的一些步骤毕现无疑,也让研究人员能够探讨DNA碱基对序列对R环形成的影响。 布里斯托尔大学生物化学系教授马克·斯兹克泽尔昆说:“我们进行的单分子实验加深了有关DNA序列对R环形成的影响的认识。这将有助于未来合理地重新设计CRISPR酶,以提高其精确度,将脱靶效应(即在不需要的地方引起基因变异)降至最低。这对我们最终利用这些工具来纠正患者的遗传疾病至关重要。” 总编辑圈点: 不知基因谁裁出,免疫系统似剪刀。Cas9蛋白酶,本来是原始生命用来防御生物入侵的防御性武器,但却被人类变成进攻利器。它在人类手中犹如火箭弹,威力巨大,使用方便。但它精确度有限,容易误切人类不希望影响的基因段。科学家们此次通过改造显微镜,看清了Cas9破拆单个DNA的全过程。这样,人们就能将火箭弹改造成导弹,指哪儿打哪儿。曾经让患者绝望的遗传病,未来或许一针下去就解决了。来源:中国科技网-科技日报 作者:陈丹 2014年05月28日
随着人类基因组图谱的完成,对基因组的分析已经成为新的研究热点。通过对人类基因组序列的分析得到人群中与有遗传倾向或受遗传与环境因素共同影响疾病的相关基因更成为了基因组分析研究中的热点。这种对genetic risk factors的分析对临床医学和流行病学都有很大启发,促进了疾病诊断、治疗和预防等各方面的改善。在基因组分析的方法中,目前最有效的是genome-wide association study,该方法与以前的linkage analysis相比有更大的power,与candidate-gene studies相比coverage更全面,不局限于已知的可能与疾病相关的染色体区域。本文对association study的思想、方法等做简单介绍。Genome-wide association study是建立在对SNP(single nucleotide polymorphism)的确定和assay的基础上的。要真正理解Genome-wide association study我们就要首先明确SNP的相关知识。任何两个人的基因组序列都是99.9%一致的,但那其余0.1%的不同却可能对个人对某些疾病的易感性有很大影响。在基因组中每一个loci都可能有不同的alleles,基因组中最常发生的polymorphism就是single nucleotide polymorphism,即SNP, 这些SNP在基因组中的密度大约是每300bp一个。研究中通常只选取minor allele frequency(MAF)在5%以上的SNP位点进行比较,以确保统计学意义。通过对遗传mechanism的研究发现,相隔在50kb以内的SNP在由亲代传给子代的过程中更容易发生linkage disequilibrium(LD),即有physical proximity的SNPs更倾向于以block的形式遗传,所以在实际应用中每一个block中只要选择一个与其它SNPs关联度最大的SNP位点作为tag SNP,就可以通过比较和assay各tag SNP的异同,确定一个基因组的haplotype类型。在基因组研究中将个体样本的SNP按在染色体上的排列顺序单独列出,得到的序列就称为是该样本genotype的haplotype组成。国际上的HapMap Project通过选取各代表性人种的大量个体,已经得到了由多于3.1 million SNPs标记的annotated,high-resolution map。此后的具体实验中只要将case组的haplotype与已得到的map进行matching,就可以知道可能与疾病易感性相关的SNP位点,进而得到相关的染色体区域。有了关于SNP的知识,我们就可以理解,Genome-wide association study是一种通过high-density array 进行genotyping从而确定polymorphism,并和统计学方法相结合,进而得出与疾病相关可能性很大的genetic risk factors的方法。Genome-wide association study 所确定的可能与遗传易感性相关的SNPs通过进一步的与control group中相对应的SNPs的比较而得到确认。(有时还要进行在第二个cohort中的fast-trackassay。)Genetic risk factors主要分两种类型,一是DNA序列的碱基改变,另一个是DNA序列的copy number改变。通常的association study只能确定那些和moderate risk有关的DNA序列(流行病学上对环境影响因素也只能确定那些与moderate risk有关的序列)。对碱基改变的测定在Robert Sladek 等人确定II型糖尿病(T2DM)相关loci的研究中有很充分的说明。这项研究是该种方法的标准研究,它以article的形式刊登在Nature上。它分为两个阶段,第一阶段是对有1,363个个体的法国case-control cohort的392,935个作为marker的SNPs进行genotpyping检验,第二阶段是针对第一阶段结果中与T2DM相关最显著的59个SNPs的rapid conformation。在genome-wide association study中样本的选取是很重要的,比如Sladek的这项研究中在第一阶段的样本中考虑到了要增加样本中risk alleles的含量,要尽量保证提供样本个体的表型一致,同时还要尽量排除其它系统误差对统计结果的影响。在研究中Sladek等人应用了在SNP assay中广泛使用的两个平台:Illumina Infinium Human 1 BeadArrays和Human Hap300 BeadArrays来筛查从Phase I HapMap得到的tag SNPs。该研究确定了四个有导致患common diabetes mellitus风险的variants的loci,其中一个恰好是已知与diabetes mellitus相关的TCF7L2基因,这也证明了该实验的准确度,从而也证明了genome-wide association study在elucidation of genetic traits中的可行性。DNA序列copy number的改变的检测在Lupski的feature文章中做了介绍。传统上的分子医学模型是以sickle cell disease为模型的单基因改变从而使合成的蛋白发生变异所导致的遗传疾病。但是随着人类基因组reference sequence的完成和能测定基因组改变的技术的发展,人们发现事实上基因组中由于deletion和duplication所造成的碱基对的改变是SNP所致碱基对改变的两到三倍,而且即便是在亲缘关系很近的个人之间也有很多这种由deletion和duplication所造成的基因组结构的不同。Lupski认为,这种genomic segments的deletion和duplication与sporadic disease的发生是有关的(可能是单一亲代的基因组发生rearrangement就导致疾病发生,也可能是父母双方的变异都不足以起到影响自身功能的程度,单两者在子代中的结合导致了疾病的发生)。Redon等人的研究确认了1,400个发生copy-number variation的区域,这些区域涵盖了14.5%被认为与遗传疾病相关联的基因,相关数据可以在OMIM(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim)的数据库中找到。可能导致很多复杂的mental-retardation疾病的Submicroscopical genomic deletions and duplications在临床上需要用genomic array的DNA chips确定。一旦确定某疾病是与gene dosage的异常有关,那么临床治疗和药物研发的中心都要从修正不正常蛋白的功能转向修正它们的不正常含量。鉴于variation in genomic rearrangement的普遍性,今后的association study和linkage analysis都应考虑copy number对疾病易感性的影响。最后,也许一些常见的行为表型(phenotype in behaviors)也可能是受这种个体间DNA序列copy number的不同影响的,这需要进一步的研究。在genome-wide association analysis应用中的关键知识是DNA chips的原理和应用以及统计分析。用DNA chips做SNP assay,简单说来是首先在chip上做好可能的SNPs的各种探针,然后取样本做PCR,得到的扩增样本与chip上的探针杂交,最后根据得到的荧光的位置判定样本的基因组成。随着相关技术的发展,现在的SNP chips已经可以在一个样本上检查超过500,000个SNPs。正是通过这样的方法,常见病的inherited genetic underpinnings正被一点点发现。今年的NEJM上有多篇相关报道,包括了前列腺癌、乳腺癌、糖尿病以及冠状动脉疾病。但是伴随着数据量变得前所未有的大,随之而来的从海量数据中得出统计学上有意义的关系的难度也迅速增大,因为随着数据量的扩大,在每一次assay中得到的假阳性结果数量也变大很多。面对这种情况,传统的统计方法是采用Bonferroni approach。(比如对于500,000个样本,将一般的p值0.05除以500,000,得到我们采用的cutoff p值0.0000001,这个值也被称为是genome-wide significance。)但实际中由于SNP chips的价格昂贵,所以大部分的实验检测得到的样本是很有限的;或者由于虽然基因型确实与疾病易感性相关,但是这种关联程度很低;或者由于实验中会采取分步进行assay的方法,这时即便是有很强关联程度的基因型在第一阶段都很难达到0.0000001这以标准,这些情况都会导致Bonfirroni approach的不合适。鉴于以上原因,在genome-wide association study中更让人信服的不是p值的stringency有多高,而是由一组样本得到的association在多大程度上可以在其它同样大规模的重复实验中得到证实。针对同一疾病进行的a