重结晶原理

p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 自质谱成像技术于二十世纪80年代前半期诞生以来，至今为止不断持续着技术改革，并被广泛运用于以新药研究和代谢产物研究领域为首的众多领域中。如今仍以提升灵敏度和空间分辨率、重现性等为目标，不断进行着技术改良。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 同时，也开发出多种离子化所需的基质，如何从这些基质中选出适用于检测目标化合物的基质成为重点。 span style=" text-indent: 2em " 除基质选择外，其涂布方法也会对分析结果造成很大影响，因此，现有多个应用于检测目标化合物的基质涂布方法正在研究中。大致可分为喷雾法和升华法两种方法，两种涂布方法均有自己的优缺点，现阶段经常会同时使用两种方法。本公司开发了能控制基质膜厚的基质升华涂布装置iMLayer（图1），对涂布方法进行研究。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 我们针对以往难以重结晶的基质9AA，开发了升华后重结晶的方法，并在此进行报告。此外，还将对小鼠肝脏中低分子量代谢产物的MS成像结果示例进行介绍。 /p p style=" text-align: right text-indent: 2em line-height: 1.75em " ——R.Yamaguchi, E.Matsuo, T.Yamamoto /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 1、不同基质涂布方法对MS成像分析造成的影响 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 基质涂布方法对基质的结晶形成和MS成像分析造成的影响如表1所示。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 与升华法相比，通过喷雾法生成的基质的结晶较粗，并可能因样本中所含成分的渗漏导致空间分辨率降低。均匀性较差，基质溶液干燥后结晶时会依赖湿度和温度等周围环境，因此重现性也会变差。另一方面，样本中所含化合物的提取效果较好，可能提高检测灵敏度。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 相比之下，升华法具有结晶较细、难以渗漏、均匀性好、重现性良好的特点，是高空间分辨率成像所不可或缺的方法。但相对的，其样本中成分的提取效果不佳，在灵敏度上可能存在不利的一面。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 实际的测量灵敏度依赖于检测化合物的结构。例如，在分析磷脂质等时，采用升华法便具有足够的灵敏度，诸如胺碘酮等药物可以足够的灵敏度完成MS成像（参考应用文集B61）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 另一方面，在检测小鼠肝脏等器官中含有的ADP 和ATP 等低分子量代谢产物时，通过升华法进行基质涂布，由于没有任何提取效果，无法得到足够的灵敏度。因此，绝大多数例子都是通过喷雾法涂布9AA来实施MS成像，但其空间分辨率相对较低。于是，我们对将DHB和CHCA上使用的升华后重结晶法涂布9AA所需的条件进行了研究。 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/0178e2f4-5edd-42fd-ab37-3b27f1e3173b.jpg" title=" 微信截图_20200619165723.png" alt=" 微信截图_20200619165723.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " 图1 基质升华装置iMLayer /p p style=" text-align: center " 表1 基质涂布方法对结晶形成和MS成像分析造成的影响 /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/962223c2-c637-4894-9498-e953c6d6b688.jpg" title=" 2.png" alt=" 2.png" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 2、基质升华后重结晶法 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " 对9AA进行升华后重结晶。如图2所示，将含有5%甲醇的滤纸和升华处理后的样本放入相同容器中，于37℃的恒温环境下静置5分钟。此时，滤纸中的5%甲醇蒸发，渗入样本中，在提取样本中化合物的同时会使少许9AA结晶溶解。之后将其真空干燥器内干燥10分钟，使溶解的9AA进行重结晶。 /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/b1b946ad-81b9-4670-bd42-0b2b1b03f739.jpg" title=" 33333333333333.png" alt=" 33333333333333.png" / /p p style=" text-align: center text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " 图2 9AA升华后重结晶的方法 /span /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/8767d240-e8eb-44fc-8470-cff5822571a1.jpg" title=" 444444444.png" alt=" 444444444.png" / /p p style=" text-align: center " 图3 成像质谱显微镜iMScopeTRIO /p p style=" text-align: center " 表2 iMScope i TRIO /i 测量参数 /p p style=" text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/69636f83-0667-4f8a-a02b-4d1c757bc977.jpg" title=" 55555555555.png" alt=" 55555555555.png" / /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " span style=" color: rgb(0, 112, 192) " strong 3、使用升华后重结晶法提高MS成像灵敏度 /strong /span /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 对9AA升华后重结晶的小鼠肝脏样本，使用成像质谱显微镜iMScope& nbsp i TRIO /i （图3），根据表2的参数进行质谱成像分析。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 对比升华法进行基质涂布样本与升华后重结晶样本的分析结果、比较其分析区域的平均质谱图（图4）。仅采用升华法时、能强烈检测到基质9AA的峰（m/z 385.14）（图4▼），基本上检测不到低分子量代谢产物的峰，但通过实施升华后重结晶，使来自低分子量代谢产物的峰强度增加（图4▼等），确认其提升检测灵敏度的效果。此外，其他多个低分子量代谢产物的MS图像，通过升华后重结晶的处理，能够获得更为清晰的MS图像（图5）。 /p p style=" text-align: justify text-indent: 2em line-height: 1.75em " 针对难以重结晶的9AA开发的升华后重结晶方法，充分利用升华法的优势成功实现了无损且高灵敏度的MS成像分析。 /p p span style=" text-indent: 2em " /span /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/0bbf3127-6052-4b6a-af7e-a0c6fc57f542.jpg" title=" 6.png" alt=" 6.png" / /p p style=" text-align: center " 图4 质谱图（升华法和升华后重结晶法的比较） /p p style=" text-align: center" img style=" max-width:100% max-height:100% " src=" https://img1.17img.cn/17img/images/202006/uepic/de208828-8702-40d6-8202-037e64b3f190.jpg" title=" 7.png" alt=" 7.png" / /p p style=" text-align: center " 图5 MS图像（升华法和升华后重结晶法的比较） /p p br/ /p

在纤维纺丝、薄膜拉伸和塑料注塑成型加工过程中，聚合物结晶一般都发生在高速取向变形过程中，这一过程还伴随着聚合物的应力松弛。因此聚合物结晶、取向和松弛这三种非平衡动力学过程相互竞争，对应的调控因素例如加工温度、应变速率和拉伸应力就共同决定着聚合物材料制品最终的半结晶织态结构及其综合性能。在国家自然科学基金委的项目支持下，南京大学胡文兵课题组在采用动态蒙特卡洛分子模拟研究应变诱导聚合物结晶微观机理方面近年来取得了一系列的进展。分子模拟结果揭示了应变诱导结晶成核阶段所存在的分子内链折叠成核和分子间缨状微束成核之间的竞争关系（Polymer, 2013, 54, 3402）以及结晶成核、晶体生长和后生长三个阶段不同的链折叠变化趋势及其微观机理（Polymer, 2014, 55, 1267）；研究还推广到双链长分布聚合物（Chin. J. Polym. Sci., 2014, 32, 1218），无规共聚物（Soft Matter, 2014, 10, 343 Eur. Polym. J., 2016, 81, 34 Polymer, 2016, 98, 282），溶液聚合物（J. Phys. Chem. B, 2016, 120, 6890），结晶/非晶共混物（J. Phys. Chem. B, 2016, 120, 12988），外消旋共混物（J. Phys. Chem. B, 2018, 122, 10928）和短链支化聚合物（Polym. Int., 2019, 68, 225）等复杂多组分体系。最近，他们将麦克斯韦应力松弛模型引入到每条高分子链中。分子模拟结果揭示了非晶聚合物应力松弛的熵势垒微观机制（Chin. J. Polym. Sci., 2021, 39, 906）以及聚合物重复单元结构间各种局部相互作用对链扩散势垒的贡献（Polymer, 2021, 224, 123740），他们甚至还发现了低温区非晶聚合物非线性粘弹性的微观发生机制（Chin. J. Polym. Sci., 2021, 39, 1496）。他们进一步对比了引入和不引入应力松弛的聚合物拉伸结晶过程，如图1所示，发现应力松弛在结晶成核、晶体生长和后生长阶段三个阶段都发挥了独特的作用。图1：没有应力松弛（Strain-induced）和引入应力松弛（Stress-induced）的聚合物应变诱导结晶对比示意图。在结晶成核阶段，聚合物的取向变形减小了构象熵，提升了聚合物的平衡熔点，导致结晶成核的过冷度，即热力学驱动力增强，于是结晶的起始应变随温度升高而变大。增大应变速率，聚合物链内调整这一动力学效应将推迟结晶成核的发生，结晶的起始应变也相应变大。一开始他们合理地猜想应力松弛将削弱聚合物的取向变形程度，给热力学上带来不利于结晶成核的作用。由于在高速拉伸过程中应力松弛的时间窗口很小，对聚合物取向变形程度的影响较为有限，实际的模拟结果显示这一热力学效应并不明显。实际上引入应力松弛对结晶起始应变的影响与增大应变速率的效果相似，即在高温区都不改变结晶的起始应变，说明聚合物来得及链内调整；在低温区都增大了结晶的起始应变，说明应力松弛对结晶主要起到了动力学阻滞效应，而不是预期的热力学削弱效应。在晶体生长阶段，由于折叠链片晶生长动力学主要由链内次级成核机理所控制，应力松弛同样在动力学上阻滞晶体生长。于是，应力松弛显著减缓了拉伸过程中结晶度随应变增大而提高的动力学过程，导致在相同应变程度下，引入应力松弛的结晶过程所能达到的结晶度相对较低。在后生长阶段，聚合物晶体发生应变诱导的熔融重结晶过程。在这一过程中晶体的折叠链被迫打开转变为伸直链，片晶转化为纤维晶，对应于半结晶聚合物冷拉的细颈化过程。分子模拟观察到熔融重结晶带来显著的应力松弛加速现象，证明外力做功迫使折叠链晶体熔化，然后以重结晶生成伸直链纤维晶的形式将外界冲击能转化为热能耗散到周边的环境中去，从而使得半结晶聚合物表现出优异的韧性特点，不同于金属和陶瓷材料。这一阶段应力松弛与增大应变速率对结晶形态的影响有所不同：在其它条件相同时，应力松弛显著减少晶粒的数目，而增大应变速率显著减小晶粒的尺寸，如图2所示。图2：不同拉伸速率下应变诱导与应力诱导结晶的晶区形貌快照，20000对应于相对慢速的拉伸应变过程，5000对应于中速应变。这项工作揭示了聚合物应力松弛、拉伸变形和结晶这三个非平衡过程之间在聚合物取向结晶过程中的微观相互竞争机理，有助于更好地理解实际聚合物高速取向加工成型过程中的高分子结晶行为以及各种加工因素对半结晶聚合物制品内部结构和性能的调控机制。相关成果发表在Polymer（2021, 235, 124306）。论文的第一作者是博士生罗文。文章链接：https://doi.org/10.1016/j.polymer.2021.124306

成果名称 固液界面（SLIM）蛋白质结晶方法及新型结晶板研制 单位名称 北京大学 联系人 马靖 联系邮箱 mj@labpku.com 合作方式 □技术转让 □技术入股 &radic 合作开发 □其他 成果成熟度 □研发阶段 &radic 原理样机 □通过小试 □通过中试 □可以量产 成果简介： 在结构生物学领域，晶体学是获得蛋白质原子结构的最普遍方法。近年来，尽管人们对蛋白质结晶原理的认识逐步深入，并且在方法研究方面不断有新的突破，但是国际上尚没有一个通用的可以获得蛋白质晶体的方法，蛋白纯化及晶体生长是一个劳动密集、成功率比较低的工作。在这种情况下，蛋白质晶体制备技术的自动化、并行化、小型化创新将大大简化蛋白晶体生长步骤，从而提高工作效率，十分必要。 在此背景下，苏晓东课题组提出一个新的蛋白质结晶概念，即固体液体界面方法（SLIM），该方法可降低蛋白结晶筛选时对蛋白质浓度及量的要求。SLIM主要基于提前滴加池液使其干燥便于储存运输，而后在&ldquo 干滴板&rdquo 上生长晶体时滴加蛋白溶液到&ldquo 干池液&rdquo 中，这为蛋白晶体生长提供了不同的动力学途径。这个方法的一个突出优点是可以利用自动化的多通道的移液设备大批量的准备许多&ldquo 干滴板&rdquo ，从而大大简化蛋白结晶过程并增加通量。为了使这个方法能够实用化，课题组需要尝试及采用各种高通量、自动化移液系统来制造大量低成本&ldquo 干滴板&rdquo ，同时还要设计并制备合适的结晶塑料板材。 作为&ldquo 仪器创制与关键技术研发&rdquo 基金首批支持的项目，在项目资金的支持下，通过结晶&ldquo 干滴板&rdquo 制备仪器的购置，以及结晶板材生产模具的试制，苏晓东教授这一新型蛋白质结晶板的研制工作得以顺利推进。目前，苏晓东课题组已经成功制备了蛋白质结晶&ldquo 干滴板&rdquo 样品，并已获得良好的效果，相关专利申请已进入国家阶段。接下来，课题组将继续与相关公司及厂家合作，进一步研制&ldquo 干滴板&rdquo 的大批量、高通量生产技术，实现该技术成果的转化。 应用前景： 蛋白质晶体制备技术的自动化、并行化、小型化创新将大大简化蛋白晶体生长步骤，从而提高工作效率，应用前景广阔。