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http://www.bioon.com/biology/UploadFiles/201203/2012030911450761.jpg细胞S-腺苷甲硫氨酸成像图,随着每个时间点蛋氨酸(右下)的增加,荧光强度也增高通过基因工程技术使得细胞表达一种经修饰(改造)过的RNA,又称Spinach,研究人员能对活细胞中的小分子代谢物进行成像,并观察它们随时间变化是如何改变的。每个细胞新陈代谢都会产生代谢产物。假如能得知产物生成效率的话,就能辨识如癌症状态下细胞代谢的异常或确定药物能否将细胞的代谢状况恢复到正常状态。康奈尔大学威尔医学院的研究人员说发表在3月9日的《科学》杂志上的相关论文详细描述了这种先进的技术方法,这一技术将有可能彻底颠覆以往对代谢组学的认识,提供数千种细胞内代谢产物的动态变化的化学指纹图谱。威尔康乃尔医学院药理学副教授Samie R. Jaffrey博士说:“动态观察到代谢产物的变化将为我们提供新的和强大的武器,方便我们了解代谢在疾病状态下是如何改变的,并帮助我们找到可以将它们恢复到正常水平的方法”。Jaffrey博士领导威尔康乃尔的其他三名研究人员共同完成了这项研究。他说:“细胞的代谢水平调控着细胞诸多功能,也正因为如此,代谢水平的变化可以是细胞内在特定的时间内发生什么变化的写照”。例如生物学家都知道,肿瘤细胞存在代谢异常,这些细胞对葡萄糖能源的利用存在异常并产生独特的代谢产物如乳酸,从而有不一样的新陈代谢过程。Jaffrey博士说:“能够看到这些代谢异常的话,就可以了解癌症的发生发展。但是到现在为止,测量活细胞中代谢产物一直非常困难。Jaffrey博士和他的团队展开的科学研究表明:可以用特定的RNA序列来检测细胞中代谢产物的水平。这些RNAs是基于能在细胞发出绿色光的Spinach RNA设计的。Jaffrey博士研究小组修改Spinach的RNAs,使得它们一旦遇到它们专属绑定的代谢物时就关闭,造成Spinach荧光开启。他们设计出了RNA序列以追踪细胞中五个不同代谢产物包括二磷酸腺苷、细胞能量分子ATP和参与调节基因活性的甲基化过程的SAM(S-腺苷蛋氨酸)水平的变化。他说:“在此之前,一直没有人能够实时观察到细胞中代谢产物水平是如何变化的”。Jaffrey博士说:“在活细胞中运用RNA传感器,研究人员能够测量单个细胞中的目标代谢产物水平随着时间的变化而发生的改变,你可以看到这些代谢物如何响应信号刺激或遗传变化进而发生动态变化的。你可以筛选出能使得这些基因异常发生正常化的药物,我们的一个主要目标是确定药物是否能使细胞的新陈代谢正常化。新技术克服了现行的用绿色荧光蛋白(GFP)标记活细胞以充当传感器的缺点。如果将绿色荧光蛋白和其他发光蛋白质融合到能结合某种代谢物产物的自然存在的蛋白质中的话,绿色荧光蛋白和其他发光蛋白质就可以用来充当代谢感应器。但在某些情况下,代谢产物与自然存在的蛋白质结合方式会扭转蛋白质结构,进而影响已经融入到这些蛋白质中的荧光蛋白。另外,对于大多数的代谢产物,并没有可用来融合绿色荧光蛋白以制造传感器的蛋白质。通过使用RNA作为代谢物传感器,这个问题引刃而解了。Jaffrey博士说:“关于RNA令人惊奇的是,你可以得到基本上你想要结合任何一种小分子代谢物的RNA序列。他们可以在几个星期就能生产出来”。然后,这些人造序列融合到Spinach中,并在细胞中以单链RNA的形式表达。Jaffrey博士说:“这种做法能让你得到任何你想研究的小分子代谢物,以及这些小分子代谢物在细胞内的情况”,他和他的同事们将这一技术的运用范围扩大到能检测活细胞内的蛋白质和其他分子。他补充说道:该技术可应用于多种疾病研究中。Jaffrey博士说:“我们非常有兴趣研究导致发育障碍如自闭症的大脑神经细胞内的代谢如何是变化的,有很多的机会能让这一新的工具发挥用处”。这篇研究论文的合著者包括威尔康乃尔医学院药理系Jeremy S. Paige博士、Thinh Nguyen Duc博士、Wenjiao Song博士。这项研究由美国国立卫生研究院的生物医学成像和生物研究所以及McKnight基金会资助。康奈尔科技企业和商业中心(CCTEC)已经代表康奈尔大学提出了这项技术的专利保护申请。Samie Jaffrey博士是Lucerna技术的创始人和科学顾问,并持有该公司股权。此外,Lucerna技术拥有上述描述技术的相关许可证。
北京华威中仪科技代理的由美国Seahorse Bioscience 公司最新研发的XF生物能量测定仪(细胞代谢呼吸动态分析仪)XF extracellular analyzer是世界首创使用24孔及96孔微孔盘为平台,采用无损伤专利固态探针侦测技术即时同步侦测有氧呼吸O2(OCR)以及糖酵解作H+(OCAR)、 CO2产率(CDPR)的动态分析仪,透过此系统的协助,研究者得以更快的速度、更简易的设计了解细胞以及线粒体如何运用不同的受质作为能量的来源、评估疾病与氧代谢及线粒体运作状态之交互作用、分析代谢调节药物对于生理的效应、建立细胞品管系统、快速筛选出具开发潜力之药物及药物毒性评估等多种不同应用。此系统现已被广泛应用于免疫学、药物筛选、肝脏及外源性毒理、糖尿病及肥胖症、老化、干细胞、细胞生理、药物转化等各个领域,哈佛大学等名校已借助该系统在nature、cell上发表文章几十篇,其他SCI高影响因子文章200多篇,现在就拥有Seahorse Bioscience 公司的细胞代谢呼吸动态分析仪,领先下一个细胞与线粒体研究的黄金十年。
发酵过程中,细胞浓度是一个非常重要的生理参数,不但可以计算比生长速率,底物消耗速率、生物量产率和维持系数等参数,还可以及时判断是否有染菌等异常情况发生。目前测量细胞浓度的方法主要有化学法(DNA/RNA分析)和物理法(干重、光密度、呼吸商等)两大类。一般来说,与物理法相比,化学法能较准确的测量有代谢活性的生物量,缺点是花费时间长,而利用物理法测量,无法区分区分处于悬浮状态的颗粒和微生物,也无法分别活死细胞。 实现在线活细胞浓度一直是发酵领域的热门话题,仅些年来出现了不少的测量方法,依据的工作原理也是五花八门,其中最具代表性的有声学,激光散色、荧光、核磁、量热或电容。 其中法国fogale公司的测量仪器,以电容法为工作原理,直接将传感器安装与发酵罐上,可承受121℃高温灭菌,理论技术也比较成熟,是目前最为理想的适合工业级别的在线活细胞传感器。工作原理:电容传感器采用活细胞的介电特性,实时连续测量活细胞的生物体积,可应用于实验室桌面型的反应器或者是工业规模的大型反应器两对对电极位于传感器的顶部,一对用于在培养基中产生交变的电场,在电场范围内,带有完整细胞膜的细胞会在培养基中发生极化现象,发生极化的细胞可以认为是极小的电容,死细胞或者其他粒子没有完整的细胞膜,所以不能形成电容型号。另一对电极用于检测培养基中的介电信号,培养基中的介电信号和细胞的浓度是精确关联的。细胞的极化率和电场的频率纯在函数关系,当频率增加时,培养基中细胞的介电常数由低频峰(最大极化)降低到高频峰(最小极化)。这种随频率增加极化率降低的现象称为β-散射。传感器采用双频测量模式:培养基的基线在10MHz左右得到,细胞的信号在临界频率区域获得,在曲线的拐点,(动物细胞和细菌在1MHz,酵母在2MHz)我们获得了最佳的信号线性。应用:这项技术可广泛应用于各种细胞培养,生物发酵过程。已被文献证实可应用的细胞如下:动物细胞:CHO, BHK, MDCK, PERC6, NSO, HEK, Hela,Hybridoma, Vero细 菌:E.Coli, Bacillus Thuringensis, Salmonella,Streptomyces, Lactic Bacteria酵 母:Pichia Pastoris, Saccharomyces Cervisiae, PolymorphaHasenula昆虫细胞:sf9, Hi-5真 菌:Absidia