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喹诺酮是一类合成抗生素类药物,治疗系统感染疾病,并且在动物饲养中作为预防和治疗药物普遍使用。近年来,这些药物在动物组织中的残留已被引起广泛关注。联合国粮农组织、世界卫生组织食品添加剂专家联合委员会、欧盟都已制定了多种喹诺酮类药物在动物组织中的最高残留限量。 喹诺酮类药物各种残留分析方法,主要包括高效液相法(HPLC)以及与此相关的HPLC-UV、HPLC-FD、HPLC-DVD、LC-MS/MS、LC-ESI-MS/MS,另外还有荧光光谱法、毛细管电泳法和酶联免疫法等。样品前处理主要采用SPE、GPC、液液萃取等净化方法;但是目前还没有文献采用QuEchERS方法净化。而且官方所发布标准的检测方法中大多数是LCMS-SPE或者LCMS-LLE。 本方法基于QuEchERS方法原理,采用乙腈提取,然后取出1 mL净化,上机分析。本方法前处理过程简单、方便,并能同时检测马波沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、洛美沙星、双氟沙星、萘啶酸、氟甲喹;节省时间,降低基质效应。回收率达85%以上,保证实验结果的准确性、重现性;本方案方法检出限均为1.0 ug/kg,优于国标方法《GB/T 21312-2007 动物源性食品中14种喹诺酮药物残留检测方法 液相色谱-质谱 质谱法》,可供广大分析工作者使用。1、适用范围 适用于草鱼、猪肉、牛奶、蜂蜜等动物源性食品中氯霉素、甲砜霉素等药物残留量的测定。本方法检出限0.1ug/kg。2、提取(1) 猪肉、草鱼样品取5.0 g样品与2.0 g氯化钠,搅匀,加5 mL乙腈,涡旋混合1 min,振荡5 min,6000rpm下离心2 min,取 1mL上清液待净化。(2) 牛奶样品取5.0 g样品与2.5 mL乙腈,涡旋混合1 min,加2.0 g氯化钠和2.5 mL乙腈,涡旋混合1 min,6000 rpm下离心2 min,取 1mL上清液待净化。(3) 蜂蜜样品取5.0 g样品,加5 mL水溶解,涡旋1 min,加2.0 g氯化钠和5 mL乙腈,涡旋混合1 min,6000 rpm下离心2 min,取 1mL上清液待净化。 3、净化将1 mL 提取液转移到ProElut QuE 2mL Tube(Cat#:64531),涡旋混合30 S,10000 rpm下离心1 min,取上清液500 μL于浓缩管中,加水100 μL,涡旋混匀,室温下氮吹至剩余约100 μL溶液,加水定容至500 μL,混匀,过0.22 μm微孔滤膜,进LC-MS/MS分析。 4、分析条件4.1 UPLC 条件:色谱柱:Endeavosil C18,100×2.1 mm,1.8 μm (Cat#:87003)流 速:0.2mL/min进样量:5 μL 柱 温:35 ℃流动相:A: 10 mmol/L乙酸铵 B:乙腈梯度设置 时间/Min. 0 4 4.5 6 6.5 12 A(%) 80 50 10 10 80 80 B(%) 20 50 90 90 20 204.2 质谱条件:电离模式:ESI 扫描方式: 负离子扫描检测方式:多反应监测 电喷雾电压:-4500 V雾化气压力:50 psi 辅助气压力:50 psi气帘气压力:20 psi 离子源温度:500 ℃定性离子对、定量离子对、碰撞气能量及去簇电压见下表http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211549_556504_1610895_3.jpg5、实验结果 草鱼、猪肉、牛奶、蜂蜜样品中氯霉素类药物的LC-MS/MS检测添加回收结果 http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211552_556505_1610895_3.jpghttp://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211605_556507_1610895_3.jpg氯霉素多反应监测色谱图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211605_556508_1610895_3.jpg甲砜霉素多反应监测色谱图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211605_556509_1610895_3.jpg草鱼空白样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211606_556510_1610895_3.jpg草鱼加标样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211606_556511_1610895_3.jpg猪肉空白样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211606_556512_1610895_3.jpg猪肉加标样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211606_556513_1610895_3.jpg牛奶空白样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211607_556514_1610895_3.jpg牛奶加标样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211607_556515_1610895_3.jpg蜂蜜空白样品总反应监测图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2015/07/201507211607_556516_1610895_3.jpg牛奶加标样品总反应监测图
本文采用瓦里安1200L LC/MS,考察了氯霉素和磺胺类药物的二级质谱的实验条件和线性范围, 氯霉素和磺胺二甲嘧啶浓度分别低至0.1ppb和1ppb时仍有较好的响应中国加入WTO后,既给我国的政治、经济和文化的发展带来了机遇,同时也带来了挑战。目前,我国畜禽产品很难进入欧美等发达国家,这是因为他们利用我国畜禽疫病防治体系不健全、产品卫生质量管理难以达到要求以及滥用农药、兽药、饲料添加剂等造成药物残留而设置技术性贸易壁垒。因为,农、兽药的残留危害极大,可引起人类的癌症、畸形、抗药性及某些中毒现象,所以发达国家对食品安全极为重视,美国1998年1月开始实施"HACCP",明确规定了食品中的有害物质(包括细菌、药残等)的临界值,超标的一律不许上市。欧盟不开放我国畜禽产品的主要原因就是药物残留和禁药问题。 氯霉素(CAP)是一种高效抗生素,是一种潜在的致癌物,在美国、加拿大和欧盟,氯霉素严禁用于产肉动物,蜂蜜和动物饲料中。目前美国FDA和世界其他政府部门纷纷提高了对进口虾、蜂蜜、奶产品中CAP含量的检测要求。在目前所有的检测氯霉素残留的方法中,LC/MS/MS以其无需衍生化,样品制备简便,灵敏度高等特点而成为氯霉素残留的主要测试方法,FDA已开发出一套LC/MS/MS发法用于测定虾中的CAP含量。方法检测限达80pg/g(虾),相当于LC/MS进样浓度为800fg/µ1。 美国FDA公布的禁止在进口动物源性食品中使用的11种药物名单,其中包括磺胺类药物,1999年10月开始,欧盟对不少磺胺类抗球虫药也颁布了禁令。为了满足越来越高的检测要求,需要开发出与之相应的检测方法,LC/MS/MS成为其最有效的方法之一。采用VARIAN 1200L LC/MS/MS 测定氯霉素和磺胺二甲嘧啶,测定浓度分别低至0.lppb和1ppb,仍有良好的线性响应。实验仪器:瓦里安 ProStar 210 溶剂传输系统瓦里安ProStar 410 自动进样器瓦里安1200L LC/MS/MS(ESI源)
(一)食品中氯霉素的限量1999年9月我国农业部发布了《动物性食品中兽药最高残留限量》,规定了氯霉素在所有食品动物的可食用组织中不得检出。2002年3月被我国农业部关于发布《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》列为禁止使用的抗生素。欧盟、美国等国家规定动物源性食品中氯霉素的残留限量标准为“零容许量”,即不得检出。(二)测定氯霉素残留的方法①酶联免疫法。采用间接竞争ELISA筛选法,在酶标板微孔条上包被偶联抗原,样本中残留的氯霉素和微孑L条上包被的偶联抗原竞争抗氯霉素抗体,加入酶标二抗后,加入底物显色,样本吸光度值与其残留物氯霉素的含量成负相关,与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数,即可得出样品中氯霉素的含量。该方法测定低限为氯霉素0.05/g/kg。⑦GB/T 22338--2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定——气相色谱一质谱法和液相色谱一质谱法测定水产品、畜禽产品和畜禽副产品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素残留量。气相色谱一质谱法是样品用乙酸乙酯提取,4%氯化钠溶液和正己烷溶液液分配净化,再经弗罗里硅土(Florisil)柱净化后,以甲苯为反应介质,用N,O-I双(三甲基硅烷)三氟乙酰胺一三甲基氯硅烷(BSTFA+TMCS,99+1)于70℃硅烷化,用气相色谱/负化学电离源质谱测定,内标工作曲线法定量。该方法测定低限为氯霉素0.1/μg/kg,氟甲砜霉素和甲砜霉素0.5μg/kg。液相色谱一质谱法是针对不同动物源性食品中氯霉素、氟甲砜霉素和甲砜霉素残留量,分别采用乙腈、乙酸乙酯一乙醚或乙酸乙酯提取,提取液用固相萃取柱进行净化,液相色谱一质谱/质谱仪进行测定,氯霉素采用内标法定量,氟甲砜霉素和甲砜霉素采用外标法定量。该方法对氯霉素的测定低限为0.1μg/kg;氟甲砜霉素和甲砜霉素为O.1/μg/kg。