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肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是发病率高、治疗困难、死亡率高的恶性肿瘤,全球每年有1000000人死于肝癌。我国肝癌的死亡率在所有恶性肿瘤中居第二位,年死于肝癌的人数占全世界肝癌年死亡总数的53%。虽然肝癌的诊断和治疗有了长足的进步,但生存率在总体水平上变化不是很明显。迄今已建立的一系列人肝癌细胞系(cell line)和人肝癌细胞系的动物模型,为肝癌的发病机理和治疗研究奠定了良好的基础。咱们坛子里是否有做这方面工作的战友,分享一下相关文献。[img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=122088]人肝癌细胞系研究进展[/url]
[b][font=宋体]前言[/font][/b][font=宋体]在蛋白质研究领域,稳定细胞系的应用已成为生产高质量结构生物学蛋白质的关键手段。随着技术的不断进步,稳定细胞系的生成与筛选方法得到了显著改进,从而推动了蛋白质生产的高效化与精准化。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]细胞系的建立和应用[/font][font=宋体][font=Calibri]HEK293[/font][font=宋体]和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]细胞系[/font][/font][/b][font=宋体]因其稳定的蛋白表达和适当的翻译后修饰而被广泛用于结构生物学研究。这些细胞系能有效地生产具有复杂糖基化模式的蛋白质,这对于确保蛋白质的功能和稳定性至关重要。糖基化缺陷细胞系通过特定的基因改造,能够分泌脱糖基化糖蛋白,为蛋白质生产提供了更加纯净的原料。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]稳定细胞系的生成[/font][/b][font=宋体][font=宋体]传统的稳定细胞系生成技术如瞬时转染,虽然方法简便,但存在整合频率低、转基因沉默等问题。为了克服这些困难,研究者们开发出了一系列新技术,如细胞分选技术、位点特异性重组(如[/font][font=Calibri]FLP/FRT[/font][font=宋体]系统)、转座子系统(如[/font][font=Calibri]piggyBac[/font][font=宋体])、慢病毒系统以及噬菌体整合酶等,提高了稳定细胞系的生成效率和稳定性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]序列特异性基因组工程也为稳定细胞系的生成提供了新的思路。通过敲除或修饰特定的基因,研究者们能够实现对细胞功能的精准调控,从而优化蛋白质生产的效率和纯度。例如,一种同时缺乏[/font][font=Calibri]GnTI[/font][font=宋体]和谷氨酰胺合成酶([/font][font=Calibri]GS[/font][font=宋体])活性的[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]细胞系被成功开发出来,为高效筛选具有[/font][font=Calibri]GS[/font][font=宋体]标记的稳定细胞系提供了有力工具。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]稳定细胞系与瞬时转染的比较[/font][/b][font=宋体]稳定细胞系相较于瞬时转染具有多个优点,包括能够进行大规模生产和保持高水平的蛋白表达稳定性。尽管瞬时转染在某些情况下能快速产生大量蛋白,但其表达水平和重复性通常不如稳定细胞系。[/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]展望[/font][/b][font=宋体]近年来,利用稳定细胞系高效生产结构生物学蛋白质已成为研究的热点和趋势。通过引入新技术、优化筛选方法和改进整合系统,不仅能够提高蛋白质生产的效率和纯度,还能够为结构生物学研究提供更加精准、可靠的实验工具。随着基因编辑和细胞工程技术的进步,预计在未来,通过精确的基因操作能够更有效地创建和利用稳定细胞系。这些技术的进步将促进结构生物学和药物开发中蛋白质的高效和可持续生产。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]本文由义翘神州进行整理,同时提供[/font][url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][u][font=宋体][color=#0000ff]稳定细胞系构建服务[/color][/font][/u][/url][font=宋体],详情可点击了解![/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]参考文献:[/font][font=Calibri]Büssow K. Stable mammalian producer cell lines for structural biology. [/font][i][font=Calibri]Curr Opin Struct Biol[/font][/i][font=Calibri]. 2015 32:81-90. doi:10.1016/j.sbi.2015.03.002[/font]
[font=宋体]慢病毒构建稳转细胞系的原理主要是利用慢病毒载体将外源基因导入宿主细胞,并实现外源基因的稳定表达。具体来说,构建稳转细胞系的核心是将慢病毒矢量载体导入宿主细胞中,慢病毒载体通常包含病毒的复制和包装组件,以及外源基因的表达调控序列。当慢病毒载体被导入宿主细胞后,它可以利用细胞的复制和转录机制将外源基因插入宿主细胞的染色体中,从而实现外源基因的稳定表达。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]构建稳定的慢病毒转染细胞系是在细胞中稳定表达外源基因的一种有效方法。下面是一般慢病毒构建稳定转染细胞系的步骤:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、选择慢病毒载体: 选择适当的慢病毒载体,通常是一个包含[/font][font=Calibri]LTR[/font][font=宋体]、包装信号、引导[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]序列和多功能质粒载体的质粒。这个载体应该包含要表达的外源基因。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、转染慢病毒包装细胞: 使用慢病毒包装细胞系,例如[/font][font=Calibri]293T[/font][font=宋体]或其他适合的细胞系。这些细胞通常被选择因为它们能够支持慢病毒复制和包装。将慢病毒载体与包装蛋白的表达质粒一同转染进这些细胞中。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、病毒产生和收集: 慢病毒包装细胞会开始产生慢病毒颗粒,这些颗粒包含了慢病毒载体和外源基因。培养一定时间后,收集细胞培养上清液,这是富含病毒的液体。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、测定病毒滴度: 对采集的上清液进行病毒滴度的测定,通常可以通过转染一定数量的目标细胞,然后测定这些细胞的感染率来确定病毒的滴度。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、转染目标细胞: 将上一步获得的病毒用于转染目标细胞。这些目标细胞可以是要建立稳定转染细胞系的细胞。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、筛选稳定细胞系: 添加适当的筛选物质,例如抗生素,以选择表达了外源基因的细胞。这可以通过在培养基中添加抗生素,使得只有表达了外源基因的细胞能够存活下来。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]7[/font][font=宋体]、单克隆分离: 对稳定表达细胞群进行单克隆分离,以确保每个克隆都来自单一细胞。这有助于保持表达的一致性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]8[/font][font=宋体]、验证表达: 对所得的单克隆细胞系进行验证,确认外源基因的表达水平和稳定性。这可以通过[/font][font=Calibri][url=https://insevent.instrument.com.cn/t/jp][color=#3333ff]PCR[/color][/url][/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]Western blotting[/font][font=宋体]等分子生物学技术来实现。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]通过这些步骤,可以建立一个稳定表达外源基因的慢病毒转染细胞系,为后续的实验和研究提供了有力的工具。这种方法常用于基因功能研究、药物筛选和基因治疗等领域。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]慢病毒构建稳转细胞系的优点:[/b][/font][font=宋体] [/font][font=宋体]与常用的转染方法相比,慢病毒构建稳转细胞系有以下几个优点:[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]①高效性:慢病毒能够将外源基因整合到宿主细胞基因组中,实现稳定的外源基因表达。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]②特异性:由于慢病毒的感染和复制比较特异,只会影响一定类型的细胞,因此可以实现对具体细胞的选择性转染。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]③安全性:慢病毒的基因转移速度较缓慢,对宿主细胞和人体的损伤较小,因此具有较高的安全性。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service][b]稳转细胞株构建服务[/b][/url],包含过表达细胞系构建服务和[/font][font=Calibri]CHO[/font][font=宋体]稳定细胞株开发服务,详情可以关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/stable-cell-line-development-service[/font][/font]