氯化胆碱用于细胞和昆虫

[b][font=宋体]前言[/font][/b][font=宋体]杆状病毒载体表达系统（[/font][font=Calibri]Baculovirus [/font][font=宋体][font=Calibri]e[/font][/font][font=Calibri]xpression [/font][font=宋体][font=Calibri]vector system, BEVS[/font][font=宋体]）自[/font][font=Calibri]1983[/font][font=宋体]年问世以来，已广泛应用于疫苗生产、基因治疗等领域。目前已有多种[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]衍生产品获批使用，如[/font][font=Calibri]HPV[/font][font=宋体]疫苗、流感疫苗和几款兽用疫苗等。[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]具有安全性高、操作简单、可以无血清培养等优点，但同时也面临表达不稳定和蛋白质糖基化水平低等挑战。本文总结了[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]的优势和局限性。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]杆状病毒载体表达系统的优势[/font][font=Calibri] [/font][/b][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、安全性高：杆状病毒仅感染昆虫细胞，不感染其他脊椎动物，对人类健康没有不良影响。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、高效的蛋白质表达：[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]能够表达复杂或难以表达的蛋白质，例如各种酶类、寄生虫蛋白、糖蛋白等，并且能进行正确的蛋白质折叠和翻译后修饰。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、易于大规模生产：昆虫细胞可以在无血清的培养基中生长，并且易于扩大生产规模。此外，[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]不需要处理活病毒或潜在危险的病原体，降低了生产成本。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、应用广泛：广泛用于功能、晶体学和药物发现研究。[/font][/font][font=Calibri] [/font][b][font=宋体]杆状病毒载体表达系统的局限性：[/font][/b][font=Calibri] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、表达不稳定：由于病毒的细胞毒性作用导致宿主细胞裂解，这可能影响最终的产物产量和蛋白质的稳定性。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、糖基化水平较低：昆虫细胞所产生的异源蛋白质的[/font][font=Calibri]N-[/font][font=宋体]糖基化图谱与哺乳动物细胞产生的不同，这可能影响蛋白质的稳定性、生物活性或免疫原性。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、潜在的免疫反应：[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]诱导的免疫反应可能产生炎症细胞因子和趋化因子，并激活补体途径，这也可能对蛋白质表达产生负面影响。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、基因组不稳定性：杆状病毒基因组可能存在不稳定性，影响长期表达和生产稳定性。[/font][/font][font=Calibri] [/font][font=宋体][font=宋体]尽管存在一些挑战，但[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]平台近年来已经得到了显著改进，包括病毒载体的优化、病毒基因组的修饰和宿主细胞的广泛应用，这些分子进步有助于增强[/font][font=Calibri]BEVS[/font][font=宋体]平台的多样性和应用潜力。[/font][/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]义翘神州提供[/font][url=https://www.sinobiological.com/services/baculovirus-insect-protein-expression-service][u][font=宋体][color=#0026e5][font=宋体]杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫蛋白表达的一站式服务[/font][/color][/font][/u][/url][font=宋体][font=宋体]。凭借优化的表达载体和更高滴度的病毒包装技术，义翘神州在杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞蛋白表达方面具有丰富的经验，特别是针对序列较长的蛋白、病毒类蛋白、激酶、胞内蛋白以及膜蛋白等。[/font][/font][font=Calibri] [/font][font=宋体]参考文献：[/font][font=Calibri]Hong M, Li T, Xue W, et al. Genetic engineering of baculovirus-insect cell system to improve protein production. Front Bioeng Biotechnol. 2022 10:994743. Published 2022 Sep 20. doi:10.3389/fbioe.2022.994743[/font][font=Calibri] [/font]

[font=宋体][font=宋体]在生物技术的广阔天地中，杆状病毒昆虫细胞表达系统以其独特的魅力和广泛的应用前景，正逐渐受到研究者们的青睐。这一系统巧妙地利用经过改造的杆状病毒基因组，在大肠杆菌中高效复制，并通过精密的转座过程将目的基因精准地插入到[/font][font=Calibri]bacmid[/font][font=宋体]的特定位点。这一过程不仅展示了生物技术的精巧与奇妙，更为科研工作者提供了强大的工具，用以探索和研究蛋白质的功能与结构。然而，任何技术在实际应用中总会遇到一些问题和挑战。为了帮助大家更好地掌握和运用这一系统，本文将深入探讨其原理，并分享在实际操作中可能遇到的常见问题及其解决方案，以期为大家的科研工作提供有益的参考和指导。[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体]杆状病毒昆虫细胞表达系统原理：[/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]经过精心改造的病毒基因组（即杆状病毒穿梭载体[/font][font=Calibri]Bacmid[/font][font=宋体]）在此系统中展现了非凡的复制能力。它们能在大肠杆菌如[/font][font=Calibri]DH10Bac[/font][font=宋体]菌株中自如地繁衍。这一复制过程得益于供体质粒中目的基因两侧所锚定的[/font][font=Calibri]Tn7[/font][font=宋体]转座原件。这些原件与[/font][font=Calibri]DH10Bac[/font][font=宋体]菌株中的[/font][font=Calibri]helper[/font][font=宋体]质粒所编码的转座酶活性相互作用，将目的基因精准地转座到[/font][font=Calibri]bacmid[/font][font=宋体]的特定位点上。当目的基因成功插入后，会导致[/font][font=Calibri]bacmid[/font][font=宋体]上的[/font][font=Calibri]LacZ[/font][font=宋体]基因发生移码，进而通过蓝白斑筛选法轻松鉴定出阳性重组[/font][font=Calibri]bacmid[/font][font=宋体]。经过提取后，这些[/font][font=Calibri]bacmid[/font][font=宋体]便能转染昆虫细胞，开启其在昆虫细胞中的高效表达之旅。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]昆虫[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]杆状病毒表达平台的常见问题解答[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]1[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]义翘神州是否接受已构建的表达载体进行[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/protein-expression][b]蛋白表达[/b][/url]？[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]对于众多常规蛋白表达项目，义翘神州确实欢迎并接受客户直接提供的表达载体，如[/font][font=Calibri]pFastBac[/font][font=宋体]等，进行专业的蛋白表达。我们深知每个蛋白的特性独一无二，因此，我们始终致力于与客户保持紧密的沟通，共同探讨并确定最佳的纯化方案，确保最终交付的产品符合客户的期望和需求。我们承诺，通过我们的专业知识和丰富经验，将客户的表达载体转化为高质量的蛋白产品。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]义翘神州是否接受包被好的杆状病毒直接进行蛋白表达？[/font][font=宋体]对于一些常规蛋白表达项目我们同样也可以直接使用客户制备好的杆状病毒进行蛋白表达，我们也会根据蛋白的实际特性与客户沟通交流纯化方案和最终交付形式。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体][font=宋体]哪些类型的蛋白适合杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞表达系统进行制备？[/font][/font][font=宋体][font=宋体]杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞表达系统适用于多种类型的蛋白表达，鉴于昆虫细胞可实现高密度培养的特性以及相对原核系统较为完备的后修饰和蛋白折叠机制，杆状病毒[/font][font=Calibri]-[/font][font=宋体]昆虫细胞表达系统通常被较多的用于胞内定位蛋白的表达，并且其在表达一些稳定性相对较差的蛋白，比如转录因子等方面也有一定的优势。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]4[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]杆状病毒表达系统有哪些优势？[/font][font=宋体][font=宋体]杆状病毒表达系统是属于真核表达系统，在蛋白质表达方面具有许多优势，比如可容纳大量[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]插入片段、相对较高的表达水平以及类似于哺乳动物细胞的真核蛋白质修饰等。 杆状病毒表达系统是结构分析中最常用的表达系统。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]5[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]在表达后的修饰中，昆虫系统出现多条带，不同的修饰在活性上有区别吗？[/font][font=宋体]重组表达的后修饰会出现不均一的情况，但不是所有的后修饰都会对蛋白活性有影响，所以需要结合该蛋白的修饰位点在功能上的作用进行分析，不同的修饰不一定在活性上有差异。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]6[/font][font=宋体]、[/font][/font][font=宋体]目的蛋白表达后会和病毒一起释放到胞外吗？[/font][font=宋体]需要确定目的蛋白是分泌表达还是胞内表达。分泌表达的蛋白会释放到胞外，因此纯化的时候选用培养上清。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州为客户提供[url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/baculovirus-insect-protein-expression][b]杆状病毒[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/baculovirus-insect-protein-expression][b]-[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/platform/baculovirus-insect-protein-expression][b]昆虫表达平台[/b][/url]，在[url=https://cn.sinobiological.com/services/baculovirus-insect-protein-expression-service][b]杆状病毒[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/baculovirus-insect-protein-expression-service][b]-[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/baculovirus-insect-protein-expression-service][b]昆虫细胞蛋白表达服务[/b][/url]方面具有丰富的经验，特别是针对序列较长的蛋白、病毒类蛋白、激酶、胞内蛋白以及膜蛋白等。义翘神州拥有多种常用昆虫细胞系（[/font][font=Calibri]Sf9, Sf21, High-Five[/font][font=宋体]），一般来说，[/font][font=Calibri]Sf9[/font][font=宋体]更利于病毒扩增，[/font][font=Calibri]Hi5[/font][font=宋体]更利于蛋白表达。义翘采用的是[/font][font=Calibri]Sf9[/font][font=宋体]扩增病毒，[/font][font=Calibri]Hi5[/font][font=宋体]重组表达，并且凭借优化的表达载体和更高滴度的病毒包装技术，有效提高蛋白表达量，交付高活性蛋白。[/font][/font][font=宋体]详情可查看：[/font][font=宋体][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/platform/baculovirus-insect-protein-expression[/font][/font][b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州：蛋白与抗体的专业引领者，欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b][font=宋体] [/font]

市场上供应的大多数培养液的配方非常接近，这使得细胞很容易适应新的培养液。这里我将详细介绍一个方法，这个方法是保守的，在大多数情况下可以进行删减一些步骤。最简单最节省时间的情况是把细胞直接分装到新的培养液中，观察几代以保证细胞的生长参数是可以接受的。这个方法适于悬浮细胞，不过也很容易扩展到贴壁细胞。细胞的生长参数1. 翻倍时间（ Doubling Time ）细胞的翻倍时间在评价昆虫细胞健康程度的参数中是最容易测量的。翻倍时间应该在细胞处于对数期复制时测量，对于 Sf9 和 Sf21 细胞来说通常是介于 16-24 小时之间，不过大多数在 20-22 小时。dt=t × ln2/ln(Ct/Co) ，其中 dt 为翻倍时间， Co 为起始细胞数目， Ct 为经过时间 t 后的细胞数目， t 为 Co 和Ct 两次计数之间的间隔时间，所有的时间都以小时为单位。2. 细胞大小（ Cell Size ）细胞的大小是监测细胞健康程度的一个非常有用的参数。如果细胞是健康的，细胞的大小均一，都处于该细胞株体积正常变化范围的下限。细胞的大小在不同的细胞株变化是很大的。对于我用过的 Sf9 和 Sf21 ，典型的直径是 16-18 m m ，不过我知道有些细胞株小至 14 m m 或者大至 19 m m 仍然很健康。3. 滞后期（ Duration of Lag ）当细胞的密度较低时，会有一个滞后期，其长短取决于分装或者传代后细胞的密度。一般说来，该密度越低，滞后期越长。对于一个特定的细胞株来说，当这个密度高出一个阈值时，滞后期的长短与密度无关；而低于一个阈值时，滞后期无限长，细胞不再增殖。4. 低密度分装极限（ Low Density Split Tolerance ）能够在一个较短的滞后期（小于 12 小时）复苏的细胞形状较好。不过这是细胞株的特性，需要进行实验来确定你的细胞株的密度极限。我的细胞株有些在分装成密度为 5 × 104 细胞 /ml 时仍然可以很好复苏，有些细胞株分装成 5 × 105 细胞 /ml 就不能复苏了。5. 高密度极限（ High Density Maximum ）这是你的细胞能生长的最大密度，高于这个密度你的细胞将进入平台期。这个指标既和细胞株有关，又和使用的培养液有关。我建议先把你的细胞株培养至平台期，然后把一些分装到新鲜的培养液中以后，使剩下的继续生长至平台期，同时密切监测细胞状况。一般来说，细胞的培养要避免密度超过高密度极限的 80% 。对于我培养的细胞，这个极限值从 2 × 106 至 12 × 106 细胞 /ml 不等。实验步骤第一阶段：1. 准备合适体积的由 25% 体积新培养液和 75% 旧培养液（即细胞原先适应的培养液）组成的混合培养液 I。2. 将细胞以通常分装时使用的最低分装密度的两倍分装到混合培养液 I 中。3. 使细胞生长到通常培养时的较高密度，监测细胞生长参数。4. 继续以步骤 2 中的密度分装细胞到新鲜的混合培养液 I 中，直到生长参数达到可以接受的水平。有时候分装一次就可达到要求。5. 一旦细胞稳定下来，以通常使用的最低分装密度分装细胞至新鲜的混合培养液 I 中，同样监测细胞参数。6. 细胞达到较高密度后，继续以步骤 5 中的分装密度把细胞分装到新鲜的混合培养液 I 中，直到细胞的生长参数达到可以接受的水平。7. 如果细胞恢复到正常状态，进行第二阶段的实验。8. 如果细胞不能达到正常状态，新培养液可能不适于培养这种细胞。9. 如果细胞在新培养液中的生长参数达到平衡状态，虽然与正常状态不同，但是可以为实验接受，也可进行第二阶段的实验。第二阶段：1. 准备适量的由 50% 新培养液和 50% 旧培养液组成的混合培养液 II 。2. 将细胞以两倍最低分装密度分装至混合培养液 II 中。3. 如第一阶段一样，监测细胞生长指数，使细胞达到稳定状态。然后将分装密度降到最低分装密度，再使细胞达到稳定状态。第三阶段：步骤同第一阶段和第二阶段，使细胞适应混合培养液 III （ 75% 新培养液和 25% 旧培养液）。第四阶段：1. 步骤同第一阶段、第二阶段和第三阶段，使细胞适应新培养液。2 . 当细胞在新培养液中达到稳定后，监测细胞的生长指数，看是否波动过大。