顺羟基哌克昔林非对映体

本文由农业农村部环境保护科研监测所课题组所作，通讯作者为耿岳博士，文章发表于Journal of Separation Science（J Sep Sci. 2022,1– 12, https://doi.org/10.1002/jssc.202200006）。 Part 01 研究背景 乙酰甲胺磷是一种广谱有机磷杀虫剂，在作物中可通过酰胺水解转化为毒性更大的代谢物甲胺磷。乙酰甲胺磷和甲胺磷均由一对对映体组成，虽然不同对映体的理化性质相同，但在活性、毒性和降解行为方面存在显著差异。因此，开发高效的乙酰甲胺磷及其代谢物甲胺磷对映体的分离和测定方法，并开展对映体选择性研究对乙酰甲胺磷及其代谢物的评估具有重要意义。目前手性分离主要采用手性色谱柱结合HPLC、GC、GC-MS/MS和LC-MS/MS进行，但对于部分手性农药存在分析时间长、分离度差等问题。 SFC-MS/MS因具有分析时间短、分离度高、有机溶剂消耗低等优点，已广泛应用于手性农药对映体的分析。本研究建立了一种绿色、灵敏、高效的SFC- MS/MS检测普通白菜中乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体残留的方法。为了验证所建立的方法，在中国北方温室条件下，通过盆栽试验研究了乙酰甲胺磷及其代谢产物甲胺磷在普通白菜中的残留情况。此研究系利用SFC - MS/MS对蔬菜样品中乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体的选择性进行报道，为手性杀虫剂乙酰甲胺磷的科学评价提供了基础资料。 Part 02 研究结果 1、对映体拆分方法的优化采用Nexera UC SFC-MS/MS系统，经过手性固定相、流动相、有机改性剂种类及比例、背压和柱温的优化等，确定最终的仪器条件。 1）色谱条件色谱柱：Chiralcel OD-H column (250 × 4.6 mm, 5 μm) ；流动相：A (CO2)/B乙醇= 95/ 5，v /v；流速：3 mL /min；柱温：40℃；背压：10 MPa；补偿溶剂 (0.1% 甲酸甲醇溶液) 流速：0.1 mL/min； 2）质谱条件离子源参数：雾化气流速：3 L/min (N2, 99.5%)；加热气流速：10 L /min(干燥空气)；接口温度：300℃；DL温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气体流速：10 L/min (N2, 99.5%)。 质谱参数：按上述条件，不同对映体出峰时间为：R-乙酰甲胺磷(4.20 min)、S-乙酰甲胺磷(4.91 min)、R-甲胺磷(5.97 min)、S-甲胺磷(6.68 min) 。不同条件下的对映体拆分结果见（图1）。图1 SFC-MS/MS上乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体的色谱图、分离度和保留时间 2、方法学考察 对建立的对映体分析方法进行系统的方法学考察，包括线性、回收率、精密度、定量限等。不同对映体在溶剂和基质标准中均有良好的线性(具体见表1)。通过比较溶剂标和基质标进行基质效应评价，乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体在普通白菜基质中表现出较强的基质抑制效应，为了消除基质效应，本研究采用基质匹配标准溶液进行定量。乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体的定量限均为0.005 mg/kg。在3个添加水平(0.01、0.1和1 mg/kg)下对普通白菜空白样品中乙酰甲胺磷和甲胺磷进行回收率试验，评价方法的准确性和精密度。化合物在普通白菜中的日内平均回收率(RSDs)为70.4−98.5% (1.4−10.9%)，日间平均回收率(RSDs)为75.4−87.5% (6.1−13.4%)。结果表明，所建立的方法精密度和重现性良好，可满足普通白菜中乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体的测定要求。 表1 不同对映体的线性、相关系数和基质效应图2 R-乙酰甲胺磷、S-乙酰甲胺磷和Rac-乙酰甲胺磷(外消旋乙酰甲胺磷)及其代谢产物R-甲胺磷、S-甲胺磷和Rac-甲胺磷的残留量 图3 R-乙酰甲胺磷(A)、S-乙酰甲胺磷(B)、Rac-乙酰甲胺磷(C)及其代谢产物R-甲胺磷(D)、S-甲胺磷(E)、Rac-甲胺磷(F)（外消旋甲胺磷）在普通白菜中的消解曲线 3、方法应用 为验证SFC-MS/MS分析方法的有效性，对普通白菜样品中乙酰甲胺磷和甲胺磷的对映体进行了分析。结果表明，乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体在普通白菜中的降解均符合一级动力学方程，R2在0.944 ~ 0.992之间(图3)，半衰期分别为：4.39 (R-乙酰甲胺磷)、2.91 (S-乙酰甲胺磷)、3.9(Rac-乙酰甲胺磷)天、10.91（R-甲胺磷）、6.24（S-甲胺磷）和9.10（Rac-甲胺磷）天。R-乙酰甲胺磷的半衰期是S-乙酰甲胺磷的1.51倍，表明其降解具有对映体选择性；在普通白菜中甲胺磷半衰期比乙酰甲胺磷长，表明甲胺磷比其母体具有更强的持久性。 Part 03 结论 基于岛津Nexara UC系统，建立了一种快速、简便、灵敏的测定普通白菜中乙酰甲胺磷及其高毒代谢物甲胺磷对映体的分析方法，本方法可在8分钟内实现手性对映体的基线分离，每针样品仅消耗1.2 mL有机溶剂（乙醇）。同时进一步应用该方法评价了乙酰甲胺磷及其代谢产物对映体在普通白菜中的手性选择性消解规律研究。本方法具有良好的精密度和重现性，满足普通白菜样品中乙酰甲胺磷和甲胺磷对映体残留测定的要求。 关联仪器Nexera UC 所提供的解决方案• 临界流体的低粘度以实现快速分离• 提高峰容量与分离度• 利用高渗透性，对异构体或手性化合物实现快速分离• 差异化的分离模式提高灵敏度• 无分流样品导入技术提升灵敏度• 减少有机溶剂消耗，在降低成本的同时降低对环境的影响 文献题目《Enantioseparation and dissipation of acephate and its highly toxic metabolite methamidophos in pakchoi by supercritical fluid chromatography tandem mass spectrometry》 使用仪器岛津Nexera UC 作者Linjie Jiang1,2,3 Yue Geng1,2,3 LuWang1,2,3 Yi Peng1,2,3 Wei Jing4 Yaping Xu1,2,3 Xiaowei Liu1,2,31 Agro-Environmental Protection Institute, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Tianjin, P. R. China2 Key Laboratory for Environmental Factors Control of Agro-product Quality Safety, Ministry of Agriculture and RuralAffairs, Tianjin, P. R. China3 National Reference Laboratory for Agricultural Testing, Tianjin, P. R. China4 Shimadzu (China) Co., LTD. Beijing Branch, Beijing, P. R. China 声明 1、本文不提供文献原文。2、所引用文献仅供读者研究和学习参考，不得用于其他营利性活动。3、本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。 本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

目的使用沃特世(Waters)ACQUITY UPC2&trade 系统成功开发非对映体超高效合相色谱(UltraPerformance Convergence Chromatography&trade ，UPC2&trade )方法，用于四种氯菊酯异构体的基线分离。背景公众对杀虫剂使用的关注日益增长。目前使用的杀虫剂有25%为手性化合物。在这些杀虫剂中，手性在药效、毒性、代谢特性和环境方面起着重要的作用。因此，对立体选择性分离技术和分析测定杀虫剂对映体纯度的需要正在不断增长。氯菊酯是一种合成的化学品，广泛用作杀虫剂和驱虫剂。氯菊酯具有四种立体异构体(两对对映体)，由环丙烷环上的两个手性中心产生，如图1所示。因此，氯菊酯异构体的分离和定量测定颇具有挑战性。在分离氯菊酯方面，开发正相HPLC和反相HPLC的方法已经做出巨大的努力，但收效不尽如人意。我们在此展示，利用ACQUITY UPC2，在不足6分钟之内实现了四种氯菊酯基线分离。与HPLC方法相比，UPC2&trade 实现了所有异构体的完全基线分离，运行时间大大缩短；对于杀虫剂的生产厂家而言，进行日常非对映体分析UPC2不愧为理想之选。解决方案人们已经对各种手性固定相(CSPs)进行了评估，以利用手性正相HPLC和反相HPLC进行分离。Lisseter和Hambling报道了Pirkle型手性固定相用于正相HPLC条件下分离氯菊酯。总的运行时间大于30min，使用的流动相为含有0.05%异丙醇的正己烷(Journal of Chromatography，539 1991 207-10)。但是，顺式和反式对映体拆分并不理想。Shishovska和Trajkovska使用了手性ß -环糊精手性固定相，用于在反相HPLC条件下拆分氯菊酯，以甲醇和水作为流动相(Chirality，22 2010 527-33)。总的运行时间大于50min，反式氯菊酯对映体的分离度小于1.5。另外，正相HPLC条件下，CHIRALCEL OJ色谱柱也用于氯菊酯的分离(Chromatographia，60 2004 523-26)，我们的实验在表1中所示的条件下进行，得到了3个分开的色谱峰，如图2所示，该结果与文献报道一致。图3显示了利用ACQUITY UPC2系统对氯菊酯进行非对映体分离。所有四种异构体利用更短的OJ-H色谱柱在不足6分钟内实现了基线分离。实验结果总结于表2中。总的来说，与手性HPLC方法相比，当前的UPC2方法实现了更好的分离，且运行时间更短。总结利用沃特世ACQUITY UPC2系统成功分离氯菊酯得到了证明，在小于6分钟内实现了四种异构体的基线分离。与手性HPLC方法相比，UPC2方法具有更高的分离度和更短的运行时间。UPC2方法也杜绝了正相HPLC中有毒正己烷的使用。对于杀虫剂生产商而言，进行日常非对映体的分析，ACQUITY UPC2系统不愧为理想之选。

目的采用沃特世(Waters)ACQUITY UPC2&trade 系统比较正相HPLC和UPC2&trade 方法分离联二苯酚对映体的效果。背景生物体由手性生物分子，如蛋白质、核酸和多糖组成；因此，它们对药物、食品、农药和废弃化合物中的对映体表现出不同的生物反应。因此，分离手性化合物，尤其是具有药物意义的化合物尤为重要。其重要性表现是以单对映体形式获批的手性药物数量不断增加。为符合FDA关于研发立体异构药物的严格指令，制药行业在进行药代动力学、药物代谢、生理学以及毒理学评价之前，已经加强手性纯化合物的制备。在过去的10年里，超临界流体色谱(SFC)已经显示出其作为分离立体异构体(包括对映体和非对映体)的巨大前景。与传统的手性高效液相色谱(HPLC，主要是正相HPLC)相比，超临界流体色谱(SFC)平均快了3-10倍。超临界流体色谱使用廉价的CO2和极性改性剂(如MeOH)作为流动相，减少有机溶剂的消耗和处理，使分析更高效，更环保。与正相色谱HPLC相比，超高效合相色谱(UPC2)能够实现联二酚萘更快的分离(为正相HPLC的9倍)，且每次分析成本大大降低。解决方案联二酚萘是一种轴手性有机物，如图1所示。联二酚萘样品采用正相HPLC和ACQUITY UPC2系统进行分离，两种方法的主要参数见表1。图2给出了采用正相HPLC(A)和UPC2(B)分离手性联二酚萘图谱。与正相HPLC中的第二个峰18min的出峰时间相比，UPC2的出峰时间为2min，使用UPC2速度增加至正相HPLC的9倍。正相HPLC的分离度(USP)为1.73，而UPC2为2.61。这种情况也说明了使用UPC2可以大大地节约每次分析的成本。UPC2方法使用2mL的甲醇洗脱化合物，但正相HPLC需要35.28mL正己烷和0.72mL甲醇。根据有机溶溶剂的用量计，使用正相HPLC每次分析大约需要2.85美元，而使用UPC2，每次分析仅需要0.08美元。UPC2图谱中的峰形比使用正相HPLC色谱得到的峰形性对称更好。正相HPLC的拖尾因子(USP)分别为1.33和2.18；而UPC2的拖尾因子分别为1.03，1.03。UPC2图谱中的色谱峰比正相HPLC色谱峰更高，更窄，意味着更高的灵敏度和峰容量。在UPC2中，由于使用超临界CO2作为流动相，超临界CO2固有的高扩散性和低粘度对分离产生巨大的影响。高扩散性减少了由流动相和固定相间的传质造成的色谱峰扩散。低粘度可实现最佳高流速而不产生明显的压降。况且，ACQUITY UPC2大大减小的系统体积使柱外的谱带展宽降至最小。总结ACQUITY UPC2系统展示了使用UPC2在2min内实现联二酚萘对映体的成功分离。与正相HPLC相比，UPC2速度快了8倍，且得到的色谱峰更高，对称性更好。ACQUITY UPC2大大减小的系统体积使柱外的谱带展宽降至最小。速度上的改善以及使用相对廉价的甲醇代替了正己烷可大大节约每次分析的成本(正相HPLC的2.85美元/次分析对比UPC2的0.08美元/次分析)。沃特世ACQUITY UPC2是实验室常规分离对映体的理想之选。