流式图像细胞计

生命科学的研究已进入了细胞组学的研究，科学家们渴求探究细胞深层次和综合性信息，既提供细胞群体的群体信息，也关注个体细胞的差异，既能看到细胞表型的特点，更能研究细胞的功能，但目前的流式细胞技术已无法满足科学家们的应用需求。Merck Millipore公司2012年推出的FlowSight多维全景流式细胞仪第一次实现了从群体到个体，从表型到功能的综合细胞分析，引领流式细胞技术进入了崭新的时代。 FlowSight是下一代专家级流式细胞仪FlowSight是一款体积小巧，但是功能强大的下一代专家级流式细胞仪。该系统革命性地设计提高了信噪比以及荧光检测的灵敏度。标配12个检测通道，除了传统荧光强度信息，还能获得&ldquo 每个细胞&rdquo 的明场、暗场以及10个荧光图像。FlowSight可以最多配置四根激光管（405, 488, 561, 642 nm），并加配785nm激光器专用于SSC信号检测，同时还可配置96孔板自动上样系统（AutoSampler）。FlowSight具有低于10MESF的超高检测灵敏度，特别对于弱信号的检测，有明显的优势。 FlowSight突破传统流式局限，实现圈门不再靠猜FlowSight与其他传统流式细胞仪不同之处在于它带来了每个细胞的真实图像。对于每个细胞，它能够生成12张图片。所获得的图片能够鉴别来自细胞质、细胞膜和细胞核的荧光。您只需点击散点图中的每个点或直方图中的每个点，即可查看与之对应的细胞图片。因此使用者再也不用靠猜测来判断设门是否准确。在FlowSight中，设门后，使用者可以通过观察所设门内外的细胞图片来确认设门是否准确。 FlowSight拓展了流式细胞技术的应用范围，获得前所未有的深入的细胞信息1. 细胞周期细化分析FlowSight可以将细胞周期分析和有丝分裂细胞分析结合起来。如下图所示，研究人员利用FlowSight对THP-1细胞周期进行分析（如下图左图所示），通过观察每个时期的细胞图片，FlowSight不仅可以分析细胞的G0/G1,S,G2/M期，还可将M期细分为分裂前期，中期，晚期，末期，获得最全面的细胞周期数据。 2. 八色免疫分型免疫分型通常用来鉴别血细胞亚群。FlowSight最多能够同时检测10色荧光，最大程度地满足研究者的实验需求。在这个例子中，研究人员用抗CD45, CD14, CD16, CD19, CD3, CD4和 CD123的抗体以及DAPI染料对细胞进行标记。通过一系列设门分析，他们鉴别了以下细胞类群： (A) CD3+ T细胞, CD4+ 辅助T细胞 (B) CD16+ 粒细胞 (C) CD19+ B 细胞 (D) CD14+ 单核细胞 (E) CD123+ pDC/嗜碱性粒细胞. 3．NFkB核转位研究NF-&kappa &beta 作为一种广泛存在的转录因子，被激活由胞浆转入胞核，从而参与炎症反应、免疫反应、细胞凋亡、肿瘤发生等。可以将细胞核和NF-&kappa &beta 分别用DAPI和FITC染色，FlowSight可观察每个细胞是否发生 NF-&kappa &beta 核转位，并量化分析NFkB核转位程度以及发生核转位细胞的比例。FlowSight革命性地光路设计，实现独特应用FlowSight系统平台也是由液流系统，光学系统和电子系统等三大部分组成。液流系统将样本细胞悬液和系统鞘液注入流动室中，使细胞在鞘液流的约束下聚焦在液流的中心，逐个流过检测窗口。光学系统中光源照射通过检测窗口的细胞，从而产生光信号。光源分为两种，其一用于产生明场细胞图像，另一种是用于产生荧光细胞图像的激光器。光源照射细胞产生的光信号被大数值孔径的物镜收集，然后通过光路系统传递到由二向色镜构成的滤光片堆栈（Dichroic Filter Stack）。光信号在这里被分成不同波段投射到TDI CCD的相应检测通道上，产生一个明场细胞图像，一个暗场细胞图像（Side Scatter，SSC）及至多10个不同荧光通道的细胞图像。FlowSight的光路系统能够自动调整焦距，并实时测定细胞运动速度，而其采用高端航空遥拍CCD进行信号采集，信噪比比PMT提高10-20倍，上述这些手段保证了系统采集到的细胞图像的质量和荧光信号的灵敏度。 综上，FlowSight多维全景流式细胞仪，采用革命性的技术，解决了传统流式细胞仪无法获得细胞个体信息的局限，真正让流式细胞仪睁开了&ldquo 眼睛&rdquo ，不仅可以对大量细胞进行统计学分析，而且还能观察细胞形态，极大地拓展了传统流式细胞仪的应用。虽然FlowSight是在2011年推出的，但是Amnis公司的下一代流式技术已经非常成熟，全球装机已经超过200台，超过300篇文献发表，其中大量Nature、Science和Blood等高水平文章。

历经多年的发展，流式细胞技术被广泛用于免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、细胞生物学及医学检验等诸多领域，扮演着愈加重要的角色，极大的推动了基础研究与临床实践的发展。默克顺势而为，近期推出了新的CellStream流式细胞仪系统，那么新在哪里呢？ 一、特点优势 极高的荧光灵敏度检测和区分细胞亚群 精确绝对计数，兼具单管和高通量上样系统 升级灵活，适应当前和未来的需要 直观易操作的软件，加快数据的发现 二、技术革新 该流式细胞仪最高可配置高达7根激光，22个检测通道以满足科研人员深入研究的需要，它使用基于时间延迟积分CCD（TDI-CCD）的检测器进行检测，快速捕获细胞图像并将其转换为高灵敏度的荧光数据进行数据发现，其独特的光学系统和设计为研究人员在分析细胞和亚微米粒子时提供了无与伦比的灵敏度和灵活性。 三、应用创新 这个新系统可以用于广泛的研究领域，包括细胞外囊泡研究和外泌体，它可以识别其他细胞仪上看不到的小群体。同时，该系统独特的液流技术使其具备精确细胞计数功能，易于在实验室中直接升级。 默克生命科学应用解决方案业务部门负责人Jean-Charles Wirth提到：“研究人员在实验室和研究能力方面越来越需要更强大的能力和灵活性。”我们的新型流式细胞仪系统提高了检测灵敏度，允许科学家根据他们在免疫学、癌症研究和许多其他领域的需要来定制仪器。 四、应用举例 CellStream在细胞外囊泡（EV）检测中的应用 细胞外囊泡（EV）作为细胞间通讯关键介质的重要性近年来引发热烈关注。EV是膜衍生结构，包括外泌小体、微囊泡和凋亡小体。 在以下研究中，分别在三台CellStream仪器上检测使用CD235ab-PE和CD41-APC荧光抗体标记的红细胞和血小板来源的EV。图（A）显示EV的圈门策略，利用该门识别 PE+和 APC+群体。（B）显示浓度梯度稀释下EV荧光散点分布。（C）显示浓度梯度稀释下EV平均荧光强度。（D）显示浓度梯度稀释下EV样品组、抗体对照组、Triton-X 100（TX）+ 抗体对照组、TX +EV对照组以及PBS对照组的颗粒浓度对比。（E）显示数据统计结果。 A: B:C: C: D: E: PE+ Objects/μL Dilution EVs Ave EVs SD Antibody Ave Antibody SD TX+Antibody Ave TX+Antibody SD TX+EVs Ave TX+EVs SD Buffer Ave Buffer SD 1:60 2442 546 160 54 55 28 30 8 5 4 1:120 1199 89 99 49 17 7 13 5 19 1 1:240 566 39 44 22 15 9 9 3 17 1 1:480 235 43 64 108 18 14 13 9 9 1 1:960 154 21 32 37 10 5 10 5 15 2 APC+ Objects/μL Dilution EVs Ave EVs SD Antibody Ave Antibody SD TX+Antibody Ave TX+Antibody SD TX+EVs Ave TX+EVs SD Buffer Ave Buffer SD 1:60 1629 316 9 2 9 9 3 0 1 1 1:120 798 187 4 1 2 1 1 1 0 0 1:240 386 56 2 1 2 1 1 0 0 0 1:480 172 50 2 3 1 1 1 1 0 0 1:960 109 33 1 1 0 0 1 0 0 0 点击这里查看更多详情

NovoCyte Penteon是一台灵敏的流式细胞仪，具有5激光和多达30个荧光通道。它具有出色的灵敏度、分辨率、速度和灵活性。它还具有7.2 log的宽动态范围以及全自动补偿功能，让用户能够在同一实验中检测暗淡信号和明亮信号。在上一代智能化流式细胞仪基础上，提供了更强大的处理能力，以适应更高端的使用需求。搭载自动上样系统NovoSampler Q，兼容40管流式管架、 24/48/96/384孔板等多种上样方式，还可以整合到不同的实验室自动平台。简便及友好的NovoExpress 软件，在数据获取、分析及报告方面带来更可期待的用户体验。仅限研究使用。不可用于诊断目的。- 5激光30荧光通道- 超凡灵敏度和分辨率- 软件功能强大，支持数据边获取边分析- 智能化设计，操作无需人工值守，简化工作流程- 高通量检测自动完成- 10^7.2宽动态范围检测，无需电压调节- 高速收集，最高可达100,000次/秒- 准确的体积法绝对计数功能，无需计数微- 优异的散射光分辨率，可检测小至100nm的颗粒具有流体反馈控制机制始终保持非常稳定的流速。在各种样品流速下具有出色的稳定性，可在不同的操作条件下提供一致的结果。新版NovoExpress，继续保留传统的优秀功能之外，提供了更多高级分析方法：- 细胞周期分析模块：除了之前的Watson Pragmati算法之外， 又新增了Dean Jet Fox（DJF）分析模型。为G1，S和G2 / M的定量拟合、以及其他参数（如CV's和G2 / G1 比率）的量化提供了更多选择， 尤其适合药物处理后的不规则周期分析。- 细胞增殖分析模型：自动分析细胞增殖，快速识别细胞分裂代数，并计算增殖指数，便于定量。- 热图数据显示：用户定义参数的颜色，方便快速查看并同时比较多个样品。 应用领域：- 癌症/免疫学- 药物及疗法开发- 病毒感染研究- 疫苗开发- 细胞生物学- 干细胞- 微生物学/水生生物学- 植物学性能指标：激光器数量5激光器配置UV/紫色/蓝色/黄色/红色荧光通道30工作原理：无与伦比的光电检测器硅光电倍增管 (SiPM) 是基于硅基底的固态半导体器件，具备光子能级灵敏度，动态范围为 7.2 个数量级，是一款具有光子计数功能的紧凑检测器。NovoCyte Penteon 设计中的创新光学器件包含 30 个独立的 SiPM，可收集并处理来自每个荧光通道的信号。出色的散射光分辨率，可检测小颗粒NovoCyte Penteon 散射光检测光学系统和信号处理电子器件经过优化，可以分辨粒径小至 0.1 µ m 的颗粒。凭借这种优异的分辨率，可轻松识别和分析血小板、细菌和各种亚微米颗粒。高重现性和稳定性NovoCyte Penteon 和 NovoCyte Quanteon 的液路系统专为提供高性能而设计。NovoCyte Penteon 和 NovoCyte Quanteon 拥有其他流式细胞仪无法比拟的液路一致性和稳定性。使用蠕动泵的其他仪器通常会受到液路脉动的影响，导致绝对细胞计数不一致和不准确。应用：凋亡分析细胞凋亡也称为细胞程序性死亡，是细胞调控自身死亡的过程，通过激活特定通路使细胞发生收缩、凝聚，并最终通过吞噬作用被清除。这与坏死细胞死亡形成鲜明对比，坏死细胞死亡时细胞失控死亡并裂解，可产生免疫反应异常激活等有害影响。因此，凋亡细胞以非常有序的方式死亡，可限制其对周围细胞和组织的破坏。多种方法可用于测定细胞死亡并区分其为凋亡还是坏死。NovoCyte 流式细胞仪具有自动补偿设置和宽荧光检测动态范围，可轻松对检测进行定量，无需调整 PMT 电压免疫表型分析免疫状态与疾病状态、治疗效率以及对疫苗等外部刺激的反应有关。免疫表型分析可快速识别候选细胞类型、亚类和功能。由于免疫细胞可能影响疫苗的免疫原性及其效能，因此监测多种免疫细胞群的频率以及特定细胞亚群（如单核细胞、NK 细胞、T 细胞和 B 细胞）的分化或活化状态至关重要。NovoCyte 流式细胞仪可同时定量分析多种白细胞，以便更好地了解患者的免疫状态并监测机体对传染病的免疫反应。细胞增殖细胞增殖是一种重要功能，是高度结构化的事件，如果不受控制，会导致疾病。我们可以通过绝对细胞计数或使用染料（例如 CFSE）测量增殖。当 CFSE 标记的细胞发生分裂时，染料在子细胞之间平均分配，随着染料的不断稀释，我们可以测量 CFSE 荧光随时间的损失。此外，还绘制染料的平均荧光强度 (MFI) 与细胞浓度随时间的变化曲线，以揭示两者之间的反比关系。这类分析方法通常用于观察 T 淋巴细胞活化的变化。图：使用 CFSE 测量 Jurkat T 细胞增殖。A) 使用 CFSE 标记 Jurkat T 细胞，并通过 NovoCyte 流式细胞仪分析细胞随时间的变化，以测定细胞分裂。每个峰值都对应于一个单独的时间点。B) 使用随细胞分裂产生的信号稀释，绘制绝对细胞计数与 CFSE 的平均荧光强度 (MFI) 随时间的变化曲线。细胞因子检测细胞因子是免疫细胞对病原体、自身免疫或治疗药物的激活反应所必需的小分子。细胞因子的信号传导可以调节基因调控、先天免疫反应和适应性免疫反应以及炎症。因此，测量细胞因子产生并确定细胞因子产生的来源对于深入了解免疫反应非常重要。基于微球的流式细胞术检测是测量细胞因子的高效方法，可以使用具有不同荧光强度的混合微球来测量单个样品中的多种可溶性分析物。细胞内蛋白质检测对细胞内蛋白质的检测和分析有助于细胞亚群和细胞过程的额外表征。为分析非细胞表面蛋白质，需要进行细胞固定和破膜。然而，许多磷酸特异性抗体与许多基于去垢剂的常用破膜方法（用于细胞内染色）不兼容。在确定磷酸特异性抗体的适宜固定和破膜方法时，需要特别注意。最常见的方法是用 1.5% 多聚甲醛固定，然后用 100% 甲醇破膜。虽然这种方法适用于多种抗体，但请注意，并非每种磷酸特异性抗体都适用。此外，在异质性样品中鉴定不同的细胞群，需要对表面蛋白连接的磷酸化蛋白进行染色。必须特别考虑这些表位对固定剂的敏感性，并采取相应预防措施，避免损害表位。因此，样品在固定前可能需要对特定的表面标记物进行染色细胞周期分析正常的人体细胞是含有恒定数量 DNA 的二倍体。在细胞分裂的过程中，DNA 合成导致总 DNA 含量翻倍，随后在有丝分裂后恢复正常的 DNA 含量。利用 NovoCyte 流式细胞仪，可以进行详细的细胞周期分析，了解肿瘤细胞分化、细胞转化以及细胞与化合物之间的相互作用。图：在 10 µ g/M MG132 或 500 µ g/M 5-FU 处理 16 小时后，使用 ACEA NovoCyte 流式细胞仪分析 A549 细胞的细胞周期分布。NovoExpress 内置的细胞周期分析模块中的图像显示了处于 G0/G1 期（绿色）、S 期（黄色）和 G2/M 期（蓝色）的细胞。与正常未处理的细胞相比，MG132 处理的细胞停滞在 G2/M 期，而 5-FU 处理的细胞停滞在 G0/G1 期。