盐酸胍蛋白变性专用

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  • 简述盐酸胍的用途

    1. 可用作医药、农药、染料及其他有机合成中间体。可用来合成2-氨基嘧啶、2-氨基-6-甲基嘧啶、2-氨基-4,6-二甲基嘧啶，是制造磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶等磺胺药物的中间体。　　2. 盐酸胍（或硝酸胍）与氰乙酸乙酯反应，环合为2,4-二氨基-6-羟基嘧啶，用于合成抗贫血药叶酸。还可用作合成纤维的防静电剂。　　3. 也可用于蛋白质变性剂。化学性质如下：1.性状：白色或微黄色块状物2.熔点（℃）：181-1833.相对密度（g/mL,20/4℃）：1.3544.溶解性：在20℃时在100g水中可以溶解228g，在100g甲醇中可以溶解76g，在100g乙醇中可以溶解24g。几乎不溶于丙酮、苯和乙醚。5.pH 值（4%水溶液,25℃）：6.4

  • “蛋白变性”的望文生义

    现在人们是越来越注重食品健康了，于是任何关于某种食品不健康的说法都能吸引一堆眼球。有人说自己买的乳清蛋白粉不容易溶在水中，立刻有人跳出来说千万不能用热水，蛋白质会变性。于是有一堆看起来对蛋白质有一点了解的人纷纷附和，大谈如何保持蛋白不变性。 很多人看到“蛋白变性”这个词，就望文生义地想到“变质”“变坏”，仿佛“变性”了就有害健康了。最常见的还有一个例子，反对微波炉的人总是说微波炉会导致蛋白质的变性。 蛋白质通常是由20种不同的氨基酸组成的，不同的蛋白质只是各种氨基酸的组成和连结方式不同。因为各种氨基酸的理化特性不同，它们会互相影响，最后会像积木一样形成一定的空间结构。通常也就说是蛋白质的天然构象。如果因为某种原因，蛋白质分子失去了它的天然构象，被称为变性。而蛋白质被吃到肚子里，首先要被水解（消化）成一个个的氨基酸分子，才能被吸收。而在多数情况下，变性的蛋白更容易被水解。可见，蛋白质变性对于食物来说，不仅不是“变质”，而且是好事。 我们所吃的所有蛋白，比如肉、鱼、鸡蛋、牛奶、豆浆、豆腐，作熟的过程就是蛋白质变性的过程。豆浆中的蛋白质不变性是变不成豆腐的。而作为商品出售的各种蛋白粉，多数都经过了高温灭菌和干燥处理，早已经变性了。对于某些产品而言，适当的工业处理甚至能够提高蛋白质的品质。比如大豆中的蛋白，其蛋白质质量指数（蛋白质消化校正计分）是0.91 ，但是经过分离纯化高温干燥等处理之后，就能达到1了。还有相当多的蛋白质产品甚至经过了酶解处理，以获得更好的理化特性。那些蛋白质，不仅是空间构象，连化学结构都变了，更是“变性”得深入。

  • 包涵体蛋白复体常见十大问题解析

    [font=宋体]在生命科学领域中，包涵体复体的研究占据了重要的地位。但随着研究的深入，一些问题逐渐浮现。本文将对包涵体复体研究中常见的挑战进行解析，以及为研究者提供一些解决思路。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]①包涵体复性原则[/b]：[/font][font=宋体]低浓度，平缓梯度，低温。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]②怎样洗涤包涵体？[/b][/font][font=宋体][font=宋体]通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用[/font][font=Calibri]6M[/font][font=宋体]盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到[/font][font=Calibri]4M,[/font][font=宋体]离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]③对于尿素和盐酸胍该怎么选择[/b][/font][font=宋体][font=宋体]尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素[/font][font=Calibri]8-10M[/font][font=宋体]，盐酸胍[/font][font=Calibri]6-8M[/font][font=宋体]。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为[/font][font=Calibri]70-90%[/font][font=宋体]，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]盐酸胍溶解能力达[/font][font=Calibri]95%[/font][font=宋体]以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b][font=宋体]④[/font][font=Calibri]8M[/font][font=宋体]尿素溶解的包涵体溶液应如何保存[/font][font=Calibri]?[/font][/b][/font][font=宋体][font=宋体]在[/font][font=Calibri]4[/font][font=宋体]度放置半个月，都没什么问题 。在室温放置超过[/font][font=Calibri]48[/font][font=宋体]小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些处理[/font][font=Calibri]BI[/font][font=宋体]溶液比较好。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑤复性时的蛋白浓度[/b][/font][font=宋体][font=宋体]一般使用浓度为[/font][font=Calibri]0.1-1.0mg/ml[/font][font=宋体]，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑥蛋白复性后浓度低[/b][/font][font=宋体]蛋白可能是在复性的过程中发生降解了。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]可以将复性好的蛋白浓缩一下跑胶看看。复性过程一般都是低浓度蛋白，需要保证分子间有足够的折叠空间。一些未正确折叠的蛋白就存在于沉淀中，可能沉淀看不出来，复性后的蛋白高速离心看看。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑦复性中蛋白析出是怎么回事？该怎么处理？[/b][/font][font=宋体]出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]复性应该采取复性液浓度和[/font][font=Calibri]PH[/font][font=宋体]值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔[/font][font=Calibri]1[/font][font=宋体]个[/font][font=Calibri]PH[/font][font=宋体]或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]若加变性剂尿素可加到[/font][font=Calibri]2M[/font][font=宋体]，盐酸胍可加到[/font][font=Calibri]1-1.5M[/font][font=宋体]；[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]另外可将甘油浓度增加，范围可在[/font][font=宋体]≤[/font][font=Calibri]30%[/font][font=宋体]，且在复性样品中也可加适量甘油。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑧复性效果的检测[/b][/font][font=宋体]根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。[/font][font=宋体][font=宋体]光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（[/font][font=Calibri]CD[/font][font=宋体]）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。[/font][/font][font=宋体][font=宋体]色谱方法：如[/font][font=Calibri]IEX[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]RP-HPLC[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]CE[/font][font=宋体]等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。[/font][/font][font=宋体]生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。[/font][font=宋体]黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。[/font][font=宋体][font=宋体]免疫学方法：如[/font][font=Calibri]ELISA[/font][font=宋体]、[/font][font=Calibri]WESTERN[/font][font=宋体]等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑨变性的[url=https://cn.sinobiological.com/resource/protein-review/fusion-protein]融合蛋白[/url]可以制备多抗或者单抗吗？[/b][/font][font=宋体]变性蛋白只是天然蛋白伸直的了产物，用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决定簇也会暴露出来，如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的，如果用来检测天然蛋白，可能会有假阳性。做单抗也可以，同样道理，筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部，是否能用还要看将来该单抗用来干什么。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体][b]⑩纯化后的可溶性融合蛋白可以直接用于制备多抗吗？[/b][/font][font=宋体]免疫动物要求抗原体种尽量小。在这种小体积的情况下，缓冲液里的小分子成分只要没毒影响就不大，可以不用考虑。[/font][font=宋体] [/font][font=宋体]更多蛋白复体详情可以关注义翘神州网！[/font]

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  • α-乳清蛋白变性引起的荧光各向异性光谱变化
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  • 非变性质谱在生物制药完整蛋白分析中的应用
    p 　　何为非变性质谱?就是选用温和的溶液体系及质谱条件，使蛋白保持在非变性状态下被分析。听到这，有些小伙伴可能会一头雾水：师兄师姐教我处理蛋白质样品的时候，第一步就是要变性啊，怎么现在又不要变性了? /p p 　　在通常的蛋白质相关分析中，为了破坏蛋白质的三维立体空间结构，便于酶解等操作，会通过加热或是加入高浓度的变性试剂(如尿素、盐酸胍等)，使蛋白质变性 另外，对于常用的分离手段——反相色谱来讲，其流动相的酸性pH条件与高有机相同样也会使蛋白质变性。当需要对蛋白质中的非共价结合进行研究时，为了避免非共价结合被强烈的变性条件所破坏，则需在非变性的液相-色谱条件下(通常为50mM醋酸铵，pH=7的中性体系)进行研究 另外，对于组成较为复杂的蛋白样品，在非变性条件下分析时，由于体系中质子数减少，所以蛋白电荷态数目也会相应减少，电荷态之间的相互重叠度也会下降，进而减少复杂组分之间的相互影响，从而能够得到复杂蛋白样品中每个组分的分子量信息(图1)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图1_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/56171fe8-be7c-4cc8-a672-814a9fe87e30.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　 strong 图1 /strong 同一样品分别于变性及非变性条件下进行分子量测定的原始谱图 /p p 　　目前， strong 非变性质谱技术主要应用在两个方面 /strong ：一是 strong 生物制药领域 /strong ，通过打开单克隆抗体链间二硫键后在Cys位点上偶联小分子药物(Cys-ADC)的完整分子量分析，此类药物的链间仅靠非共价力结合，故变性条件下各条链会分离，无法测得其完整状态的分子量 另一应用方向为 strong 研究蛋白质多聚体 /strong ，非变性条件下不仅可以保持各个亚基间的非共价相互作用，同时由于中性条件更接近生理状态，得到的结果更具意义。 /p p 　　现在，非变性质谱与氢氘交换、X-ray衍射、核磁共振、冷冻电镜和cross-linking等技术联合使用、互为补充，已经越来越多的被应用在结构生物学、生物医药等领域的研究中。本期文章将会重点介绍非变性质谱在治疗性生物医药制品完整分子量测定中的研究，下期文章将会侧重介绍非变性质谱用于蛋白复合物的研究进展。 /p p span style=" COLOR: #002060" strong Orbitrap超高分辨质谱：非变性质谱研究的理想平台 /strong /span /p p 　　古人云：工欲善其事，必先利其器。要想研究做得好，趁手工具不可少!针对于非变性质谱研究中的需求，我们在Orbitrap质谱平台上对相关参数进行了优化，包括离子源区脱溶剂能量、质量范围的扩展以及高质荷比离子传输效率的优化等，使Orbitrap在固有的高分辨率、高质量精度及高灵敏度基础上，在非变性质谱领域也能有出色表现。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图2_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/caeec8f3-896f-4e02-a44a-84aae9ecd287.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图2 /strong Orbitrap质谱平台用于非变性质谱分析 /p p 　　上文中提到，在生物制药领域中，会通过分子工程设计，在单克隆抗体的特定氨基酸上通过化学反应，偶联上小分子治疗药物，通过单克隆抗体的靶向识别功能将小分子药物精确带至病变细胞处并释放，达到精确给药、减少毒副作用的目的，这类药物被称作抗体药物偶联物(Antibody Drug Conjugates，ADCs)。在这类药物中，通过将单抗链间二硫键打开从而在Cys位点上偶联药物的Cys-ADC，由于其链间仅靠非共价力结合，故需在非变性质谱条件下才能对其完整分子量进行测定(图3)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图3_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/270ff8dd-d5c1-442b-baf1-f287fcb557b9.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　 strong 　图3 /strong Cys-ADC结构示意图 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　图4展示了使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量的结果。由图中不难发现，使用体积排阻色谱(SEC)，可以将单克隆抗体与其他杂质分离开，而Orbitrap质谱平台能够得到基线分离、信噪比高的原始谱图。经数据处理软件解卷积处理后，可见偶联了0/2/4/6/8个小分子药物的簇峰分布，符合Cys-ADC的典型分布特征 解卷积后计算所得该ADC的药物/抗体比值(Drug to Antibody Ratio, DAR)，与之前报道过的DAR值相符。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图4_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/b494de8a-6ac5-42cf-ad12-d84637e32bef.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图4 /strong 使用非变性质谱平台对Cys-ADC进行完整分子量测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。 /p p 　　作为对照，在变性条件下也对同一个样品进行了分子量测定(图5)，发现链间的非共价结合在强烈的变性条件下均被破坏，只能观察到部分ADC的分子量信息。该实验进一步说明了在非变性条件下对Cys-ADC进行分子量测定的必要性。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图5_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/46b85220-b769-47dc-b534-f92c93b56cff.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图5 /strong 变性质谱条件下对Cys-ADC进行分子量测量。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　(上)，原始色谱/质谱图 (下)，解卷积后谱图。 /p p 　　对于常见的另外一种ADC——Lys-linked ADC，虽然其小分子药物与单克隆抗体是通过共价键相结合，但偶联上小分子药物后，ADC的复杂度大大增加，此时若在非变性条件下进行分子量测定，可以减少信号之间的干扰，得到更加准确的测量结果(图6)。 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 图6_20170406090915_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/7c9e60f0-f01a-45eb-85eb-f9dceece9c46.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　▲非变性条件可减少复杂组分间信号重叠 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" img title=" 非变性2_20170406090518_副本.jpg" src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201704/insimg/e634be51-bf68-49f2-b7be-e205227a7242.jpg" / /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　▲非变性条件下Lys-ADC完整分子量测量结果 /p p style=" TEXT-ALIGN: center" 　　 strong 图6 /strong 使用非变性质谱平台对Lys-ADC进行完整分子量测量。 /p p 　　 strong 小结 /strong /p p 　　本期我们对非变性质谱技术的原理、适用范围进行了介绍，并以Cys-ADC与Lys-ADC样品的完整分子量测量为例展示了该方法的应用，不知道小伙伴们有没有对非变性质谱技术有个初步的了解呢?下期我们将会介绍该技术在蛋白复合物研究中的应用，各位看官走过路过不要错过，我们下期见! /p p 　　参考文献 /p p 　　[1] Dabaene et al., Anal Chem. 2014, Nov 4 86 (21):10674-83. /p p & nbsp /p
    时间： 2017-04-06
    作者： guohn
  • RapiGest SF试剂：促进溶液中蛋白酶解的有利工具
    Ying Qing Yu与Martin Gilar 美国马萨诸塞州米尔福德沃特世公司 简介 本应用纪要中，我们介绍了沃特世专利RapiGest&trade SF试剂的物理化学性质及其应用领域。2002年，我们首次推出RapiGest SF，这一创新产品是帮助酶消解的有利工具，可促进溶液中蛋白的消解，它能够改善样品制备过程中蛋白的溶解度。 RapiGest SF提高酶解速率与完全程度的机理详见图1。温和的蛋白变性可打开蛋白结构并暴露酶切位点，以供酶切。在RapiGest SF溶液中，酶对变性的耐受性优于普通蛋白，并能保持活性。在加入酶之前高温加热RapiGest SF溶液可使球蛋白更为完全变性，之后需将酶与样品一起进行37 ° C的孵育。 图1 蛋白底物在RapiGest SF溶液中变性􀉼 之后对蛋白酶切更为敏感 超过200多家行业内杂志引用了使用RapiGest SF进行样品溶解的案例，大部分为蛋白组学的应用。最近，许多制药实验室使用RapiGest SF用于蛋白药物的确证。因为酶消化的速度的提高并在LC、MS分析前极易清除，RapiGest SF已被多个应用领域广泛接受，其中包括高级序列研究的LC/UV/MS蛋白药物的肽图分析。 讨论 什么是RapiGest SF? RapiGest SF是酸性不稳定表面活性剂，在酸性条件下极易水解。1这种独特的性质，在需要的时候，可用于从溶液中清除表面活性剂。RapiGest SF的结构及其水解副产物见图2。酸性不稳定的性质可在pH2条件下，45分钟内达到完全降解。 该表面活性剂可降解为两个产物：dodeca-2-one和3-（2,3-二羟基丙基）丙磺酸钠。前者与水不能互溶，可通过离心清除。后者在水溶液中溶解度很高，而在反相LC模式下不保留。酶消解后的水溶液可直接进行HPLC、LC/MS或MALDI-TOF MS进行分析。 消解后的清除 样品分析前无需额外去清除表面活性剂（如透析）。在分析前，酶消解后通常经过酸（如甲酸、三氟乙酸（TFA）或盐酸（HCl））的酸化，降解RapiGest SF。建议降解条件pH &le 2。 胰蛋白酶消解的兼容性 胰蛋白酶是最常见的蛋白水解酶，可用于肽图分析和蛋白组学的应用。我们研究了在添加RapiGest SF的情况下胰蛋白酶的活性作用，并与文献中最常见的变性剂的作用做了对比。本检测基于胰蛋白酶诱导N-&alpha -苯甲酰-L-精氨酸乙基乙酯（BAEE）在50 mM重碳酸胺（pH 7.9）中的室温水解。胰蛋白酶活性的变化通过UV 253 nm下测量BAEE水解率进行计算。在选择的变性溶液中，胰蛋白酶活性与对照样品进行对比（非变性剂）。结果见于表1。 表1中的数据说明低浓度下（0.1%） RapiGest SF不抑制胰蛋白酶的活性。这与结构上类似的表面活性剂SDS不同，SDS是很强的变性剂，可会使胰蛋白酶失活。尿素、乙腈或盐酸胍也是胰蛋白酶消化的变性剂。但是乙腈是强洗脱剂会干扰消解样品进行反相LC分析。正如我们所知，尿素可使蛋白共价修饰，盐酸胍也和SDS一样可以使酶失活。 本实验说明蛋白酶的活性受到蛋白溶液中所用变性剂的影响。RapiGest SF在从低到高的浓度下均不改变酶活性，因此，最佳的蛋白消解条件是无需过量酶即可达到酶解的结果。 快速蛋白消解 对蛋白酶解存在抗性的蛋白使用RapiGest SF试剂，可在数分钟内消解完全。完全消解球蛋白、马肌红蛋白只需要5分钟内即可完成。该试剂辅助的消解结果与对照见图3。由于肌红蛋白是球蛋白，众所周知，若没有表面活性剂将难以消解。在对照反应中，与胰蛋白酶孵育9小时后只有少量的蛋白可以消化。使用了RapiGest SF试剂，总体的消解的效率显著提升。 在蛋白药物肽图中的序列覆盖范围更大 RapiGest SF在蛋白组学的样品前处理中广泛使用，是有效的蛋白溶解变性剂。最近越来越多的生物制药实验室在肽图分析中采用了RapiGest SF。一些发表的论文记录了使用RapiGest SF进行蛋白药物消解的优势。4,5经报导的RapiGest SF浓度范围为0.05 -1%，取决于蛋白疏水性与浓度。 我们发现浓度范围为0.05 -1%的RapiGest SF足以使各种大小的蛋白变性，高浓度RapiGest SF适合全细胞蛋白提取的实验。 单抗（mAbs）肽图分析一直以来都因为难以消解这些大疏水蛋白而难以实现。肽图分析的目的是确认蛋白序列并发现所有存在后翻译修饰（PTMs）的蛋白。图4举例说明了RapiGest SF辅助的人单抗消解的实例。样品制备与分析的参数以UPLC® 和四级杆Tof质谱分析的参数已列表作为指导。 图4显示实验中总序列覆盖率为98%。数据分析通过BiopharmaLynx&trade v.1.2软件得到。高序列覆盖率（98%）说明单抗完全消解。LC/MS分析中没有发现错误酶切的多肽或完整未被酶切的蛋白。剩下的2%未确认的序列为少数二个氨基酸的肽或单个氨基酸（R或K），而无法在反相柱上保留。 样品制备 人单抗样品（10 &mu L, 21 mg/mL）在含有0.1% （w/v） RapiGest SF 的50 &mu L 50 mM重碳酸铵中溶解。将2 &mu L 0.1 M的二流苏糖醇（DTT）加入样品，样品在50 ° C加热30分钟，加入4 &mu L 0.1 M的碘代乙酰胺，在样品冷却至室温后样品在黑暗中静至40分钟。 样品中加入8 &mu g胰蛋白酶（胰蛋白酶浓度= 1 &mu g/&mu L），样品在37 ° C孵育过夜。消解样品与1%甲酸与10%乙腈混合（1：1，v：v）。用Milli-Q水（Millipore）稀释至5 pmol/&mu L后进行LC/MS分析。 LC 条件 LC 系统 沃特世 ACQUITY UPLC® 系统 色谱柱 ACQUITY UPLC BEH 300 C18 肽分离专用柱, 2.1 x 100mm （P/N = 186003686） 柱温 40 ° C样品进样 2 &mu L （10 pmol） 溶液A 0.1% 甲酸水溶液 溶液B 0.1% 甲酸乙腈溶液 流速 200 &mu L/min 梯度 0-2分钟:2%B 2 &ndash 92分钟：2 -35% B 92 -102分钟：35 - 50% B 102.1 -105 分钟：90% B 105.1-110分钟：2% B MS条件 MS系统 沃特世SYNAPT&trade MS （V型） 毛细管电压 3.2 kV 源温度 120 ° C 去溶剂温度 350 ° C 去溶剂气 700 L/hr MS 扫描速率 1 秒/次 锁定质量通道 100 fmol/&mu L Glu-Fib多肽（m/z 785.8426, z = 2），流速20 &mu L/min 与其他的蛋白酶合用 我们测试了RapiGest SF与多种蛋白酶的适配性，如Asp-N, Lys-C与Glu-C。在酶解前使用RapiGest SF变性蛋白获得了有效的消解结果。 蛋白去糖基化的用途 RapiGest SF也用于测试其它酶，如PNGase F，该酶用于酶切糖蛋白N-连接的糖基。2图6说明了去糖基化鸡蛋卵清蛋白。在RapiGest SF介质中PNGase F消解2小时后观察到了完全的去糖基化反应。 结论  RapiGest SF促进了蛋白酶解的速度与完全程度，能够得到蛋白药物序列覆盖率很高的肽图分析。  RapiGest SF是适用于蛋白组学、糖蛋白与生物制药应用的领域  几乎无需消解后样品处理，简单样品酸化，足以从溶液中去除RapiGest SF。多种情况下LC/MS分析前只需简单稀释。  RapiGest SF简化了样品制备方法，可提高分析通量；使用该方法提高实验室工作效率并提高数据质量。 参考文献 1. Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC. Enzyme-friendly, mass spectrom- etry-compatible surfactant for in-solution enzymatic digestion of proteins. Anal. Chem. 2003 75: 6023-6028. 2. Yu YQ, Gilar M, Lee PJ, Bouvier ES, Gebler JC, A complete peptide mapping of membrane proteins: a novel surfactant aiding the enzymatic digestion of bacteriorhodopsin. Rapid Commun.Mass Spectrom. 2004 18: 711-715. 3. Yu YQ, Gilar M, Kaska J, Gebler JC. A rapid sample preparation method for mass spectrometry characterization of N-linked glycans. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2005 19: 2331-2336. 4. Bailey MJ, Hooker AD, Adams CS, Zhang S, James DC. A platform for high- throughtput molecular characterization of recombinant monoclonal antibodies, J. Chrom. B. 2005 826: 177-187. 5. Huang HZ, NicholsA, Liu DJ. Direct identification and quantification of aspartyl succinimide in an IgG2 mAb by RapiGest SF assisted digestion. Anal. Chem. 2009 81 (4): 1686-1692.
    时间： 2010-09-13
    作者： Waters
  • 高分辨非变性质谱绘制人血清蛋白全貌图
    大家好，本周为大家介绍的是一篇发表在Analytical Chemistry上的文章Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry1，文章通讯作者是来自荷兰乌得勒支大学的Albert J. R. Heck教授。　　血清中大多数蛋白都是糖基化蛋白，这些糖蛋白对疾病诊断有着重要意义，基于质谱的糖链释放后分析和糖肽分析是目前普遍使用的糖蛋白分析方法，但仍存在一些局限，例如可能遗漏同时发生的翻译后修饰、缺乏对O-糖的研究、遗漏某些糖肽覆盖不到的糖基化位点等。高分辨非变性质谱为完整糖蛋白的分析提供了新的思路，本文开发了一种基于离子交换色谱的分离纯化方法，能够从150μL血清中分离和分析20多种血清(糖)蛋白，质量范围在30-190 kDa之间。　　图1为血清糖蛋白的分离和分析方法。150μL血清首先经过亲和柱以快速去除大量的白蛋白、IgG和血清转铁蛋白等，这一步骤使用的是作者内部制造的机器人，可以加快过柱子的速度。接着血清被送入离子交换(IEX)色谱，使用40分钟的梯度时，大多数蛋白在14-27分钟内洗脱，故作者在13-30分钟内每隔0.5分钟收集一次级分，并将每个级分缓冲液换为乙酸铵溶液，最后进行Thermo Exploris Orbitrap质谱仪分析。　　　　图1.血清糖蛋白非变性质谱分析方法　　作者使用该方法分离了大约24种血清蛋白，并在文中详细介绍了其中4种蛋白的分析过程：α-1抗胰蛋白酶、补体C3、血红素结合蛋白、铜蓝蛋白。　　(1)α-1抗胰蛋白酶(A1AT)是一种丝氨酸蛋白酶抑制剂，在呼吸系统的功能中起重要作用，作者使用唾液酸酶和PNGase F确认了蛋白上的糖型，又通过TCEP的还原处理发现大部分血清样品的A1AT都是半胱氨酸化的，也确认了A1AT存在N端截短的特征，综上，作者共统计出了13个A1AT异质体。针对捐献者提供的血清，作者区分出了携带V237A和E400D突变的A1AT蛋白的供体。　　(2)补体C3蛋白在免疫调节过程中发挥作用，在血清中浓度相对较高，分子量为187kDa。与该蛋白共流出的还有两种约137kDa和80kDa的蛋白，在唾液酸酶处理后，只有80kDa的蛋白质量减少很多，证明其存在唾液酸，而C3和137kDa蛋白的糖型上无唾液酸。通过对级分的糖肽分析确定N糖位点在Asn 63和Asn 917。137kDa蛋白鉴定为C3缺失α链后降解而成。　　(3)血红素结合蛋白(HPX)在血清中的主要功能是结合和运输游离的血红素，进行血红素和铁的再循环。非变性质谱显示HPX质量范围在58-63 kDa，而蛋白质主链质量仅50 kDa。本文首次解析了血清HPX的蛋白型谱，证明了4-5个N-糖和1个O-聚糖的存在，共17种独特的糖型。　　(4)铜蓝蛋白(CER)负责在人体内转运大部分的铜，分子量132kDa，每个CER分子可以携带6-7个铜离子。CER在非变性质谱检测后的分子量比理论质量多409±5Da，作者将其归为6个铜离子和1个钙离子的结合所致，并发现了CER完全去糖后失去结合金属离子的能力。　　　　图2.绘制血清糖蛋白组的全貌图。观察到的血清蛋白质量范围为30-190 kDa，浓度范围为0.2-50g/L　　总结：本文开发了一种从少量人血清中分离多种糖蛋白的方法，并通过高分辨非变性质谱表征了蛋白型谱，为蛋白全貌提供完整视图。该方法的优势在于非变性质谱需要的样品处理步骤少，最大程度的还原了蛋白的生理状态，劣势在于目前通过完整质量只解析了20余种蛋白中的8种，后续需要结合自下而上或自上而下的蛋白质组学方法进行辨别。在未来的研究中，作者建议联用分子排阻色谱和离子交换色谱，实现高通量在线血清蛋白分离分析。　　撰稿：英语佳 编辑：李惠琳　　原文：Charting the Proteoform Landscape of Serum Proteins in Individual Donors by High-Resolution Native Mass Spectrometry
    时间： 2022-09-15
    作者： ONE
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  • 岛津蛋白测序仪 400-612-9980
    岛津集团发布新型PPSQ-51A单反应器蛋白测序仪和PPSQ-53A三重反应蛋白测序仪。 新PPSQ-51A / 53A蛋白质测序仪采用岛津SPD-M30A光电二极管阵列检测器，配有新型毛细管流通池，灵敏度是原型号标准检测池的10倍，能进行较长序列的蛋白质研究。 主要特点：1、在等度洗脱模式下进行PTH-氨基酸的分析，等度序列分析提供更稳定的保留时间。这意味着可以使用色谱减法取消在以前的周期中检测到的峰，方便用户识别正确的氨基酸。在等度洗脱模式下进行PTH-氨基酸分析也使实验室通过流动相回收减少废液的浪费，降低运行成本。2、操作简单，专业的蛋白质测序仪将对反应单元和高效液相色谱分析单元提供控制功能，便于进行序列分析。3、新PPSQ软件可配置为满足实验室的各种需要，无论是监管、研究和开发，还是学术。该软件符合FDA 21 CFR Part 11指南对安全、用户管理和审计跟踪的要求。易于使用的数据分析功能，简化操作，数据处理和报告。这些功能允许色谱的后处理、多重色谱的叠加、色谱减法、和氨基酸序列的自动估计。此外，PPSQ-51A / 53A音序器提供定制的报告，并对数据进行快速、全面的的图形显示。拥有以前机型的客户（31A/33A/51B/53B）可以升级现有系统为相同灵敏度，并能拥有和PPSQ-51A / 53A一样的软件。升级包在有高层次的灵活性以及数据库的标准版和客户端服务器版本中都可以使FDA 21 CFR Part 11合规。
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    厂商： 岛津企业管理（中国）有限公司
    品牌： 岛津/Shimadzu
    型号： PPSQ-51A/53A
    价格： 面议
  • NanoTemper Prometheus Panta 蛋白稳定性分析仪 化学变性实验 400-860-2855
    Prometheus Panta蛋白稳定性分析仪[ 稳定可靠地提供高分辨率的稳定性表征 ]产品简介：Prometheus Panta蛋白稳定性分析仪可搭载微量差示扫描荧光nanoDSF (nano Differential Scanning Fluorimetry）技术、动态光散射DLS (Dynamic Light Scattering)技术、静态光散射SLS (Static Light Scattering) 技术以及背反射（Backreflection）技术模块，首次实现在整个热升温过程中，【同时且实时地】检测样品构象、粒径和聚集变化，实现对生物制品进行高分辨率、多维度的稳定性表征，监测整个生物制品研发和生产流程中的关键环节，加速生物药开发进程。技术原理PR Panta 可搭载四项技术模块，使您深入洞察目标样本。&bull 差示扫描荧光 (nanoDSF)：无标记测量热稳定性或化学稳定性&bull 动态光散射 (DLS)：测量样品中分子的大小分布&bull 静态光散射 (SLS)：关联散射强度与粒子分子量&bull 背反射 (Backreflection)：检测聚集状态产品优势：&bull 四大技术模块：可灵活升级，可同时开启&bull 无需标记样品：利用蛋白质内源荧光检测，无需添加染料，可进行无标记Thermal Shift Assay&bull 操作简便：仅需 10μL 样品，通过毛细作用加载样本，一“吸”一“放”即检测&bull 可升级自动化机械臂，实现全自动无人值守&bull 兼容去垢剂，可检测高粘度样品&bull 无液流系统，免维护应用领域：&bull 抗体等蛋白制品制剂筛选&bull 抗体等蛋白制品长期储存稳定性预测&bull 抗体等蛋白制品质量控制&bull Biosimilar一致性评价&bull 蛋白纯化及储存缓冲液条件筛选&bull 膜蛋白去垢剂筛选&bull 配体结合筛选（TSA试验）案例概述【化学变性实验】Boehringer-Ingelheim的研究人员使用PR进行化学变性实验，用不同浓度的化学变性剂例如盐酸胍将样品孵育一段时间后检测其折叠自由能ΔG。 同Tm一样，ΔG也可以用来评估蛋白的构象稳定性, 也有文献报道可以通过检测不同浓度下ΔG的变化来预 测其聚集倾向。如果ΔG不受浓度影响，则蛋白没有聚集倾向 。如果ΔG随着浓度增加而增加 ，表明 native-state aggregation会使折叠状态的蛋白更加稳 定。如果ΔG随着浓度增加而降低，表明蛋白倾向于聚 集。 Boehringer-Ingelheim的研究人员检测了单抗在五种 制剂中ΔG随浓度的变化，除F04号外，其余制剂中ΔG 随着抗体浓度的增加明显降低。17个月的长期稳定性 测试结果也显示在4号制剂中抗体的稳定性最佳。Dennis Breitsprecher, Pawel Linke et al. Predicting the aggregation propensity of mAbs using chemical and thermal denaturation on a single, fully automated platform. NanoTemper Technologies application note. 2017.耗材支持：&bull NanoTemper在线商城小程序（微信搜索）&bull NanoTemper官网关于NanoTemper: 德国NanoTemper始创于2008年，总部位于慕尼黑。作为全球知名的科学仪器制造商，历经十余载发展，在全球13个国家设立分支机构。 我们始终致力于为蛋白质分析研究提供更加优质的解决方案。基于专利微量热泳动技术（MST）、微量差示扫描荧光技术（nanoDSF）和光谱位移技术（Spectral Shift）等创新技术，公司先后推出分子相互作用检测仪（Monolith系列）、蛋白稳定性分析仪（Prometheus 系列）、高通量亲和力筛选系统（Dianthus系列）以及新品蛋白质表达和功能快速筛选系统 （ Andromeda X ）。 NanoTemper以优质的产品与服务迅速赢得全球知名药企、生物技术公司、服务公司和科研机构的好评，成为优选合作伙伴。需要更多信息或希望获得个性化解决方案？请随时联系我们~
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    厂商： 诺坦普科技（北京）有限公司
    品牌： NanoTemper
    型号： Prometheus nanoDSF
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  • 盐酸胍原料生产厂家供应现货
    中文名称盐酸胍英文名称Guanidine Hydrochloride中文别名胍,盐酸盐 盐酸亚氨脲CAS RN50-01-1EINECS号200-002-3分 子 式CH6N3Cl分 子 量95.5388危险品标志 Xn:Harmful风险术语R22 R36/38 安全术语S22 物化性质性状 白色或微黄色块状物。熔点 181~183℃相对密度 1.354溶解性 本品20℃时溶解度：200g/100克水，76g/100g甲醇，24g/100g乙醇。几乎不溶于丙酮、苯和乙醚。用　　途主要用作药物的中间体，是制造磺胺嘧啶、磺胺甲基嘧啶、磺胺二甲基嘧啶和叶酸的重要原料我公司关于订购说明：1、质优价廉，量大从优，欢迎您的订购；2、物流信息：快递、汽车物流等；3、其他服务：如您对产品服务及技术指标有特殊要求，请及时通知我方；欢迎新老客户前来洽谈！订购流程：电话询单议价→签订合同→打款订货→安排发货→物流跟踪→货物送达→客户验收（7天产品质量异议期，15天产品数量异议期）→货物验收确认服务宗旨：竭诚提供 产品,售后服务客户满意。我公司产品出厂前均由质检部检验合格方可出货，质量有保证特别说明：1，产品价格会受到季节性波动影响，具体价格请客户来电核实2，产品都是完整包装，需拆分少量时价格会稍微提高3，大货急需的客户还请提前来电，我公司提前给您备货4，收货后请仔细确认完整性无损再签收，按该产品执行标准验收，如有产品不符，我们包退包换
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    厂商： 湖北速普尔化工有限公司
    品牌： 未知
    型号： 15327385931
    价格： 面议
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  • 梅特勒胃蛋白酶/盐酸清洗液
    品牌：梅特勒-托利多名称：梅特勒PH缓冲液,梅特勒校准液,梅特勒标准溶液任何一瓶都可免费提供梅特勒正版标准溶液证书（如有需要的请在购买后联系客服） 最通用的销售品所有的梅特勒-托利多校准液和清洁溶液都用方便耐用的瓶子包装，并且贴有简单的标签。 如果需要大包装的溶液，那么我们的 6 瓶装产品便是您合适的选择。 电解液使用的特殊盖子能便于您更容易地补加电解液。特定要求 我们提供的袋装溶液能确保每次校准都可以方便地使用鲜的溶液。 每盒包装上都附有打印证书。 依托梅特勒-托利多的专家意见，我们能满足您在增加供应方面的特殊需求。实现限度地符合法规并可追溯为确保可追溯性，每一校准液均附带单独的测试证书。 此外，符合规定对我们而言至关重要。 所有的 SDS 和标签均包含 GHS《全球化学品统一分类和标签制度》（规定的本地语言版本信息）。 请从我们的在线数据库下载任何所需的文档： 订购信息：pH/离子/电导/溶氧标准溶液规格表分类型号(订货号)说明溶液513431803M KCI(9823)溶液1瓶x 25mL 513500723M KCI(9823)溶液1瓶x 250mL513500803M KCI(9823)溶液6瓶×250mL513431843M KCI溶液含AgCL(9811)溶液1瓶x 25mL513500743M KCI溶液含AgCL(9811)溶液1瓶x 250mL513500823M KCI溶液含AgCL(9811)溶液6瓶×250mL51343185FriscoLyt-B® 电解液(9848) 1瓶X25mL51350076FriscoLyt-B电解液(9848)1瓶×250mL51350084FriscoLyt-B电解液(9848)6瓶×250mL51350100胃蛋白酶/盐酸清洗液1瓶x250mL51350102硫脲清洗液51350104电极活化液25mL513500022.00pH缓冲液1瓶x250mL513500044.01pH缓冲液1瓶x250mL513500184.01pH缓冲液6瓶×250mL513500067.00pH缓冲液1瓶x250mL513500207.00pH缓冲液6瓶×250mL513500089.21pH缓冲液1瓶x250mL513500229.21pH缓冲液6瓶×250mL5135001010.00pH缓冲液1瓶x250mL5135002410.00pH缓冲液6瓶×250mL513020694.01pH缓冲液30袋x20mL513020477.00pH缓冲液30袋x20mL513020709.21pH缓冲液30袋x20mL513020684.01/7.00/9.21pH缓冲液各10袋x20mL51302079 10.01pH缓冲液30袋x20mL513500524.006pH缓冲液1瓶x250mL513500546.865pH缓冲液1瓶x250mL513500569.180pH缓冲液1瓶x250mL5135005810.012pH缓冲液1瓶x250mL51302153 84uS/cm电导仪标准液1瓶x250mL513500921413uS/cm电导仪标准液1瓶x250mL513500961413uS/cm电导仪标准液6瓶×250mL5135009412.88mS/cm电导仪标准液1瓶x250mL5135009812.88mS/cm电导仪标准液6瓶×250mL513020491413uS/cm电导仪标准液30袋x20mL5130205012.88mS/cm电导仪标准液30袋x20mL51340294InLab605电解液，25mL
    供应商： 上海右一仪器有限公司
    品牌： 梅特勒托利多
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  • 绿百草科技专业提供分析盐酸替罗非班的手性柱 ES-OVM
    绿百草科技专业提供分析盐酸替罗非班的手性柱 ES-OVM 关键词：绿百草科技，ES-OVM，盐酸替罗非班 绿百草科技专业提供手性柱ES-OVM. ES-OVM的手性固定相是卵粘蛋白键合硅胶，符合美国药典L57。型号为150*4.6mm 的信和ES-OVM可用于分析盐酸替罗非班。绿百草科技可提供详细的操作条件和谱图。 需要详细的信息请和绿百草科技联系：010-51659766 登录网站获得更多产品信息: www.greenherbs.com.cn
    供应商： 北京绿百草科技发展有限公司
    品牌： 大赛璐
    价格： 面议
  • 益母草盐酸水苏碱分析专用色谱柱
    第一支进入《中国药典》2010 年版的国产亲水作用色谱柱益母草，别名茺蔚、坤草，是一种草本植物。性微寒，味苦辛，可去瘀生新，活血调经 ，利尿消肿，是历代医家用来治疗妇科疾病之要药。据现代临床及动物实施证明，益母草浸膏及煎剂对子宫有强而持久的兴奋作用，不但能增强其收缩力，同时能提高其紧张度和收缩率。益母草全草含益母草碱(Leonurine) 约0.05 %( 花初期含微量，花中期逐渐增高)，水苏碱(stachydrine)，芦丁(rutin)，延胡索酸( 反丁烯二酸fumaricacid)，益母草碱甲和益母草碱乙。细叶益母草全草含生物碱0.05 %。从化学结构上看，盐酸益母草碱和盐酸水苏碱由于含有较多的极性基团(-OH、-NH2、-COOH) 和孤对电子，水溶性特别强，因此普通的C18 反相色谱柱已不能满足此类化合物的分析要求，最重要的原因即亲水性成分在C18 柱上没有保留。为此，博纳艾杰尔独家推出一款益母草专用分析柱，即Venusil HILIC 亲水型色谱柱，它“以丙基酰胺键合硅胶为填充剂”( 引自《2010 版中华人民共和国药典》一部272 页)，对具有-OH、-NH2、-COOH 等极性管能团的化合物显示出良好的选择性，价格便宜，柱效高，稳定性强，使用寿命长。应用实例：HPLC-ELSD 法测定益母草中盐酸水苏碱的含量Venusil HILIC 柱分析色谱图色谱仪器：Agilent 1100 高效液相色谱仪；样 品：A、盐酸水苏碱对照品，B、供试品；色谱柱：Venusil HILIC（4.6×250 mm，5 μm，100 ?）；流动相：乙腈:0.2% 冰醋酸溶液=80:20；流 速：0.5 mL/min；柱 温：20 ℃；检测器：Alltech2000 型ELSD 检测器；
    供应商： 艾杰尔飞诺美
    品牌： 博纳艾杰尔
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