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HPLC法测定防己黄芪方中粉防己碱的含量摘 要目的 建立HPLC法测定防己黄芪方中粉防己碱的含量的方法。方法 采用Hypersil BDS C18色谱柱(4.6mm×200mm,5µm)。流动相为甲醇:水(含0.03%二乙胺)=80:20,柱温30℃,流速1.0mL/min,检测波长282nm。结果 粉防己碱在6.25µg·mL-1~200µg·mL-1呈良好的线性关系(r = 0.9993),平均回收率为94.4%,RSD = 1.6%,三种方法测定防己黄芪方中粉防己碱的含量分别为0.506mg·mL-1 ,0.424mg·mL-1 和0.541 mg·mL-1 。结论 本法简便,准确,重现性好,可作为防己黄芪方中粉防己碱的含量测定方法。关键词:防己黄芪汤;粉防己碱;HPLC ;含量测定Determination of Tetrandrine in Stephania andAstragalus Combination by HPLCABSTRACTObjective: To establish a HPLC method for the determination oftetrandrine in Stephania and Astragalus Combination Method : A Hypersil BDS C18 chromatographic column (4.6mm×200mm,5µm)served as the solid phase;methanol-water(80:20)(0.03% diethylamine) was used as the mobile phase;the column temperature was at 30℃;the flow rate,1.0ml/min;UV detection wavelength[fo
[align=center]原创-非洲猪瘟自检实验室试剂选择参考[/align]非洲猪瘟自检实验室,指的是屠宰场、食品加工企业、种猪场、规模猪场,在国家有关部门要求下,建立的以非洲猪瘟病毒核酸检测为主的微型实验室。这些实验室以前大多没有分子生物学检测基础和经验,对于如何选择试剂心中无数。下面提供一些选择试剂的看法,供参考:一、抗凝剂非洲猪瘟病毒核酸检测,对于屠宰场和种猪场、规模猪场来说,样品一般选择EDTA抗凝血。对于种猪场和规模猪场来说,采样量不大,推荐采购EDTA抗凝管。对于屠宰场来说,采购抗凝管确实方便,但也确实不便宜。农业农村部要求屠宰场采血做到全覆盖,试想一下:每支EDTA抗凝管成本约1元,屠宰场每天屠宰1000头,一年的抗凝管成本就是36万元。因此,在屠宰场看来,抗凝管是“想说爱你不容易”。在控制成本的策略下,自行配制抗凝剂成为不二之选。一般认为,1.5mg EDTA钠盐可以阻止1mL血液凝固。因此,每1mL血液需要用15 mg/mL EDTA钠盐溶液0.1mL。配制方法:(1)首先配制生理盐水溶液:取8.5g氯化钠,溶于1000mL纯水中;(2)配制EDTA溶液:取EDTA钠盐15g,溶于1000mL生理盐水溶液中,此时EDTA浓度为15mg/mL;(3)用法:取EDTA溶液0.1mL,置于塑料离心管或其它容器中,倾斜放置于37℃至45℃烘箱中烘干备用,可抗凝1mL以内的血液。使用方法:采血后立即将血液注入该离心管中,颠倒数次后混匀待用。如需抗凝更多血液,可按比例增加EDTA溶液用量。二、提取及扩增试剂1、提取试剂目前自检实验室普遍采用所谓的免提试剂盒,但站在专业的角度看,所谓的免提实际上是粗提,只不过省略了洗涤的过程。在此情况下,稀释核酸的试剂难免会对后续的扩增起到抑制作用。据报道,在不考虑试剂盒其他因素影响的情况下,提取核酸(也就是经过洗涤步骤)比免提取核酸(也就是未经洗涤步骤)灵敏度高10-100倍,反映到Ct值上,提取核酸比免提约低3-7左右。众所周知,屠宰场的待宰生猪,绝大多数是健康的。即便少数带毒,病毒量也极少。加上屠宰场采取混样检测,每个来源的生猪往往混成一份样品,有时混样比例甚至达到1:50。在此情况下,待检样品即使有病毒,其病毒核酸含量也被稀释得极低。如果再采用免提试剂盒,检测效果可想而知。综上,个人认为对于屠宰场,包括种猪场和规模猪场假定健康情况下,推荐采用核酸提取试剂盒,对于免提试剂盒应该慎用。2、扩增试剂目前荧光定量PCR扩增试剂已经非常成熟,一般的扩增试剂盒或者预混液,直接用于检测都能取得理想效果。因此,对于扩增试剂不需要过于纠结,选用推荐产品即可。3、引物探针及阳性对照在初步开放检测权限时,采用了“引物探针+提取试剂+扩增试剂”的模式,取得了不错的效果。在公布第二批试剂推荐名单前,多数实验室也是采用这种模式开展检测,包括参加各种比对试验。但遗憾的是,公布第二批名单后,引物探针及阳性对照不再供应,多数实验室也只能采购推荐名单产品。需要指出的是:目前市场上独立的DNA提取试剂盒,每个检测的成本约15元;通用的荧光定量预混液,每个检测的成本约10元;引物探针及阳性对照假设每个检测的成本为5元;合计每个样品提取及扩增的成本仅30元。而目前市场上非洲猪瘟检测试剂盒,供应价基本上每个检测在50-70元之间,无形之中增加了屠宰场及相关主体的经营成本。要知道,一个再小的屠宰场每天的检测量也有20份左右,每年增加的成本20份/天*360天*(20-40)元/份=(14.4-28.8)万元。基于此,强烈建议农业农村部考虑经济主体的经济承担能力,公布引物探针序列,并安排有关单位无偿或有偿供应阳性对照。三、消毒剂对于非洲猪瘟检测环境来说,极细小的污染都会造成实验结果的失败,甚至可能引起病毒扩散,因此做好消毒工作非常重要。对于非洲猪瘟来说,比较有效的消毒剂是0.8%氢氧化钠或氢氧化钾溶液。配制方法比较简单,取8g氢氧化钠或氢氧化钾溶于水即可。需要注意的是,一次不能配制太多,最好几天内用完。而且配制好的溶液,应贮存于密封的塑料喷壶或塑料瓶内,随用随取。四、灭菌指示剂按照规定,非洲猪瘟检测剩余样品、检测产物及废弃物等,均需经高压灭菌后进行无害化处理。灭菌效果是否达到要求,是一个不容忽视的问题。灭菌效果监测包括物理监测、化学监测和生物监测。物理监测:每次灭菌时观察温度、压力和时间等灭菌参数是否符合要求。温度波动范围在+3℃以内,时间满足最低灭菌时间的要求。化学监测:每次灭菌时,取一片灭菌指示卡或灭菌指示胶带,随同灭菌物品一同放入灭菌器,待灭菌结束后观察是否按规定变色。生物监测:每隔一段时间,应进行高压灭菌器生物监测,取嗜热脂肪肝菌芽胞菌片按规定程序灭菌,结束后在无菌条件下取出标准试验包的指示菌片,投入溴甲粉紫葡萄糖蛋白胨水培养基中,经56℃±1℃培养7d,观察培养结果。生化监测要求较高,涉及微生物实验操作,自检实验室可委托相关单位开展检测。