三维激光扫描仪

请问用凝胶成像能不能代替激光扫描仪进行同工酶活性百分数的测定?能打出谱图吗?

雕刻，做为一种古老的手工艺行业，是记录和承载中国灿烂历史文明的一个组成部分。然而，随着科学技术的发展和人们社会生活的变化，这种古老的靠心口相传的手工艺技艺却面临诸多的困难，而与同时，他又被提供了诸多的发展手段和机遇。 在古代，我们的每一件雕刻产品，都是靠人们的双手创造出来。因此， 每一件雕刻产品都饱含了雕刻家的心血，是智慧，文化、艺术乃至人生观和世界观的体现。所以，每一件雕刻产品都是艺术品。 然而，随着现代经济生活的发展， 随着人们生活节奏的加快，肯于钻研雕刻技艺的雕刻师越来月少了。人们在经济利益的冲击下，把科学技术应用在雕刻行业，于是出现了雕刻机。但是， 雕刻机的出现，并没有像人们当初想象的那样，可以代替全部的手工雕刻创造工作。这是为什么呢? 因为目前的雕刻机还只能进行平面雕刻。 就目前市场上的雕刻机而言，我们知道，目前还只是解决了平面雕刻的问题，或着说浮雕的问题。但从这一角度来看，我们可以预计，在不久的将来，我们会看到市场上将会出现真正的三维立体雕刻机(这就好比模具行业的五轴加工中心，六轴加工中心等等)。这种设备可以进行立体的雕刻工作，比如雕刻佛像。 那么，将来出现了三维立体雕刻机，是否就可以代替人们的全部的手工雕刻呢?答案依然是否定的。 我们知道，创造一个立体的雕刻产品。首先这种产品的三维模型是出现在雕刻师的脑子里。当然，现在我们可以把这种存在于脑子里的三维模型通过三维CAD软件转化为电脑里的三维数据模型，然后通过三维立体雕刻机雕刻出产品。但是，由于雕刻机的精度问题，由于雕刻刀的选型问题，面对有些雕刻细节，我们不得不仍然需要手工修改。 所以，我们突然会明白，雕刻机就像雕刻刀一样，说到底其实就是雕刻师的一种工具而已。 但此时我们又会发现一个问题。那就是，我们目前总是感觉雕刻机有时候雕一些高精度的细节不是很好，那是因为我们大多数的雕刻机都使用伺服马达驱动和测量定位。这种定位方法，其精度能达到0.02mm就很高了。由此，我们可以想到，如果市场有需要，将来肯定会出现采用磁栅或光栅测量定位的雕刻机---雕刻机床，定位分辨率:0.001mm。 所以，对于一部分高精度要求的雕刻机，机床的现在式就是高精度雕刻机的未来式。 我们知道，虽然雕刻机不能完全替代雕刻师手里的雕刻刀，但是雕刻机可以实现批量生产，在实现大量利润的同时，把雕刻师从繁重的重复的体力劳动中解放出来，而可以专心的进行新产品开发。 那么，新产品首件开发出来，如何转换为雕刻机的刀径线路呢? 这就需要使用我们的三维扫描仪了，通过三维扫描仪，我们目前完全可以扫描出佛像等立体的雕刻产品的外形数据。但仅仅是因为目前市场上没有三维立体雕刻机，所以，我们无法实现佛像等立体产品的批量的机械化雕刻生产。所以，由于雕刻机的限制，我们目前大多数的扫描工作，还只是满足于浮雕的需要。 关于三维扫描仪的精度，目前市场上出现的低价格的扫描仪，精度在0.1mm以下，能满足一些客户的要求。但也有较高精度的三维扫描仪，如长沙多维测量设备有限公司的雕刻机专用激光线扫描系统，扫描精度为0.045mm。当然该公司还提供模具行业使用的激光线三维扫描系统，扫描精度为0.01mm。 但是，随着高精度三维扫描仪在雕刻行业的应用和普及，也会大大的促进雕刻机的高精度化发展，甚至出现高端产品--三维立体雕刻机的问世。到那时，我们的雕刻师更会得心应手，大量的创造饱含中国文化的雕刻产品，为弘扬我国的古老文明，为世界文明的进步，作出新的更大的贡献。

摘要激光扫描共聚焦显微镜作为80年代发展起来的一种高精度分子细胞生物学分析仪器，具有组织细胞断层扫描、活细胞动态荧光监测、三维图像重建、共聚焦图像定量分析等先进功能，在近年的细胞凋亡这一研究热点中得到了大量创造性的应用。本文拟就对激光扫描共聚焦显微镜在凋亡的形态学、分子水平变化及重要生理过程三方面研究中的应用及其成果做一综述。细胞凋亡(apoptosis)是不同于细胞坏死的一种细胞主动死亡方式，并由特定的基因控制。凋亡细胞在形态上出现变圆皱缩、染色质浓缩边集、核碎裂、凋亡小体形成等变化，并最终由非炎症过程清除。由于细胞凋亡独特地影响着机体的细胞发育和代谢，在监测和清除肿瘤细胞与突变细胞等方面也可能发挥重要的作用，近年来受到了细胞生物学、分子生物学、免疫学等多学科的广泛关注。激光扫描共聚焦显微镜(laser scaing confocal microscopy, LSCM)是80年代发展起来的一种高精度分子细胞生物学分析仪器，辅以各类免疫荧光探针或荧光染料与被测物质特异性结合，不仅可观察固定的细胞组织切片，还可对活细胞的结构、分子和离子进行实时动态地观察和检测。在细胞凋亡的研究中，激光扫描共聚焦显微镜已被广泛地应用于形态学、分子水平监测及重要生理改变等各方面，其中不乏新颖之处，并获得了大量成果，以下将就此做一简单的介绍。激光扫描共聚焦显微镜与凋亡的形态学激光扫描共聚焦显微镜用点光源扫描标本的光学横断面，以代替普通光学显微镜所使用的场光源，并用探测针孔滤去离焦光线，所以消除了来自焦平面以外的衍射或散射光的干扰，可实现高清晰、高分辨率的组织细胞断层扫描。并且由于激光扫描共聚焦显微镜采用数字化成像，因而辅以一定的软件就能对图像进行定量分析及三维重建等操作。过去对细胞凋亡的形态学研究方法局限于活性细胞和组织切片染色、荧光镜观察，或者石蜡切片原位末端标记法。由于普通光镜的分辨率和清晰度有限，而电镜又显然不适合对凋亡这一复杂动态过程的监测，激光扫描共聚焦显微镜的应用使人们对细胞凋亡的形态学观察分析提高到了一个前所未有的新水平。细胞核核膜的破坏对于染色质聚集并形成凋亡小体起重要作用。lamin是构成核片层的蛋白质，位于核膜的内表面，由caase-6介导的lamin裂解可影响核膜的完整性。在McCall等的研究中，对果蝇卵子发生晚期的细胞凋亡现象进行了动态观察。以单抗mAb101标记其哺育细胞核内膜的laminDm0（哺乳类laminB的同源体），用激光扫描共聚焦显微镜加以观察。正常哺育细胞到11期时，染色的lamin呈弥散的雾状分布并围绕核周，而dcp-1GLC哺育细胞即使到了较晚的14期时，仍然显示界线明确的染色。可见dcp-1突变体在核lamin蛋白的酶切或解聚方面存在缺陷。细胞器Li 等在对C(6)-酰基鞘氨醇诱导胞内囊泡产生的研究中，在不产生中毒效应的情况下，加入10microM C(6)-酰基鞘氨醇以诱导鼠纤维母细胞(3T3-L1和3T3-F442A)凋亡。观察到囊泡的形成与C(6)-酰基鞘氨醇的诱导呈时间依从和剂量依从关系。大量小泡在其加入后8小时内出现，并且随时间而增大；大泡最终分布在核周，而小泡分布在细胞边缘。用抗-溶酶体膜蛋白抗体和共聚焦免疫荧光显微分析，证明增大的囊泡为晚期内吞体/溶酶体。另外，胞内的细胞器都有其适用的荧光探针，如高尔基复合体常用的探针有Dceramide、BODIPY ceramide等，内质网常用的有Dil、DiOC6等，经标记均可进行精细的观察。当然，激光扫描共聚焦显微镜在形态学中的优势更在于其对图像的三维重建功能，从而揭示过去只能在平面上显现的凋亡细胞在三维空间中的结构；而对细胞凋亡的动态过程，它可以用三维加时间的四维方式进行观察，来获取最逼真的形态学资料。凋亡过程中一些特征性的三维形态变化正期待着进一步具体的工作去发现。激光扫描共聚焦显微镜对凋亡细胞的分子水平监测随着分子生物学突飞猛进的发展，关于细胞凋亡分子机制的研究已有了很大的突破。细胞凋亡的信号传递途径及其调控涉及到大量的酶级联反应、生物大分子的空间转移等。而激光扫描共聚焦显微镜以其定性、定量、定时的优点，结合众多荧光探针的应用，成为了研究细胞凋亡分子水平变化的有力手段。DNA大分子DNA断裂以及染色质的异常凝聚，是细胞凋亡的关键，同时也是细胞核在细胞凋亡中具有标志性的变化。Columbara等报道将激光扫描共聚焦显微镜与原位TdT和Poll免疫荧光技术相结合，进而确定双链和单链DNA的断裂点。而在对细胞凋亡和细胞坏死区别的研究中，Kreel等在培养的K562细胞中加入放线菌素D以诱导凋亡，并对细胞的DNA片段进行了3’-末端标记。经激光扫描共聚焦显微镜观察发现K562细胞凋亡早期有大量DNA片段出现，且DNA片段弥散分布于除核仁外的细胞核区。伴随着凋亡的进展，细胞核内出现大量高标记密度的圆形小体。而采用NaN3或快速冻融法使细胞坏死，经激光扫描共聚焦显微镜观察证实，在坏死开始阶段并无DNA片段的出现，至少在坏死发生24小时后才有DNA片段产生。Caase家族Caases是一组高度保守的半胱氨酸蛋白酶，目前发现有11个成员。多数细胞凋亡是以Caase家族蛋白的激活并作用于其关键底物而实现的，而caases激活的关键又在于该家族蛋白间的级联反应，因此caases被认为是细胞凋亡的中心环节和执行者，成为研究的热点。Mandal等用激光扫描共聚焦显微镜对细胞凋亡中激活的caase-3的重分布进行了研究。用丁酸处理细胞后，观察到DNA-PKcs的裂解与caase-3的激活成正相关，而Bcl-2的过度表达则可抑制上述两个过程。同时还证明（1）激活后的caase-3重分布到核区，（2）裂解局部的DNA-PKcs和PARP（polyADP-ribosepolymerase，聚腺苷二磷酸核糖多聚酶），（3）裂解产物又被释放到核外的细胞液。caase-3的抑制物四肽DEVD-CHO又可抑制上述的三个连续的步骤。该研究提示：激活的caase-3在核内的重分布构成了丁酸所诱导的细胞凋亡中的一个重要凋亡信号。另外，在用激光扫描共聚焦显微镜对Q79诱导大鼠神经元凋亡的研究中，Sanchez等发现了Q79对caase-8的聚集和激活，而对caase-8的抑制则阻止了被诱导的细胞凋亡；加以Westernblot分析，还建立了caase-8的激活和某些神经退行性疾病（如舞蹈病）的联系。Grazyme丝氨酸蛋白酶grazyme为另一种重要的凋亡信号分子，对某些caase家族蛋白也有激活作用。Trapani等就证明了杀伤淋巴细胞利用穿孔素和grazymeB的协同作用来诱导靶细胞的凋亡，在其研究中通过激光扫描共聚焦显微镜观察到（1）50%细胞的胞核内快速聚集了以FITC荧光标记的grazymeB（最长7分钟，t1/2为2分钟），然后发生凋亡；（2）其它的细胞只有细胞液内有FITC-grazyme B的摄取，避免了凋亡。此间至少在13分钟后才有DNA碎片的出现，说明核内的grazyme B聚集出现在凋亡的执行阶段之前。并且通过对核内液的处理（加入70KDa FITC-dextran），间接观察到grazyme B的转移并非是因为核膜受caases的作用而破损，而是由于穿孔素的协同。其它以上的介绍显示，激光扫描共聚焦显微镜在检测活细胞酶活性动态变化方面有着突出的优势。实际上，对于细胞凋亡的分子机制这样一个极其复杂的课题，激光扫描共聚焦显微镜的应用远不只限于上述的几种离子和大分子，而是渗透到了大量的分枝课题中去。如在对重要的凋亡负调控蛋白Bcl-2的研究中，Beham等利用基因毒性损害（genotoxic damage）诱导细胞凋亡，并以Bcl-2蛋白抑制其凋亡过程。用激光扫描共聚焦显微镜和Immunoblotting观察显示，Bcl-2的作用在于阻止了诱导产生的p53蛋白向核内的转运。而Ohsawa等对独立于caase家族的另一种重要蛋白酶—组织蛋白酶进行了研究，用血清剥夺法诱导PC12细胞凋亡，并用激光扫描共聚焦显微镜监测了其精细超微结构改变过程和细胞内组织蛋白酶B和D的免疫活度的对比变化。又如，在人胰岛淀粉样多肽（hIA）的研究中，Hiddinga等用表达hIA的质粒转染COS-1细胞诱导凋亡，辅以免疫组化染色，用激光扫描共聚焦显微镜证明了hIA在细胞的内质网和高尔基复合体内呈簇状沉积，并与细胞