相衬生物显微镜

相衬显微镜的定义及与普通显微镜的区别： 相衬显微镜是一种特殊的显微镜，特别适用于观察具有很高透明度的对象，例如生物切片、油膜和位相光栅等等。光波通过这些物体，往往只改变入射光波的位相而不改变入射光波的增幅，由于人眼及所有能量检测器只能辨别光波强度上的差别，也即振幅上的差别，而不能辨别位相的变化，因此用普通显微镜是难以观察到这些物体的。 ------------------------------------- 透明度很高的物体，也称为位相物体。相衬法（也叫位相反衬法）是通过空间滤波器将物体的位相信息转换为相应的振幅信息，从而大大提高透明物体的可分辨性，所以从这个意义上说，相衬法是一种光学信息处理方法，而且是最早的信息处理的成果之一，因此在光学的发展史上具有重要意义。1935年泽尔尼克根据阿贝成像原理，首先提出位相反衬法，由改变频谱的位相以改善透明物体成像的反衬度，1953年泽尔尼克因此获诺贝尔物理学奖。这是诺贝尔物理学奖中少数几项与光学有关的奖项之一 ----------------------------------------- 工作原理： 实际的做法可以是，在玻璃基片的中心处加一滴液体，液滴的光程引起一定的相移，这样就形成了一块位相板，将这块位相板放置在显微镜的后焦面上，当作一个空间滤波器。在相干光的照射下，像面上出现与物的位相信息相关的图像。像面上的强度分布与样品位相成线性关系，也就是说，样品的位相分布调制了像面上的光强。 相衬法不是在使用显微镜的过程中发现的，而是泽尔尼克在工作于别的光学领域时发现的。这要从1920年泽尔尼克对衍射光栅产生兴趣时说起。这种反射式光栅是由平面或凹面镜片构成，镜片表面上刻有大量等距的刻痕。刻痕位置稍有差错，就会明显影响光栅的光学效果。刻机周期性重复出现的误差，使光程差发生相应的变化，观察者在观察镜面时，就会看到镜面似乎变得起伏不平。光栅表面细致的刻线直接用肉眼是看不见的，看到的只是在镜面上出现相隔较宽的粗线。用这样的光栅所形成的光谱，往往在每根强度谱线两侧伴随有一系列杂乱的弱线，这就叫“罗兰鬼线”。一块完善的光栅，像手掌那么大，拿在手里，在均匀照明之下，看上去色彩丰富，斑斓绚丽，展现出可见光谱里的各种颜色。可是，实际上有的光栅看上去却是“伤痕”遍布，在彩带上叠加了一条条粗线。1902年阿伦（H.S.Allen）曾宣称，这些粗线不是真实的，乃是主要谱线与其鬼线互相干涉抵消的结果。1920年泽尔尼克在研究光栅时，对这一说法表示异议。他认为这些带“伤痕”的表面视场要比照像底片拍摄所得的光谱照片提供了更多信息，表面视场给出了鬼线的相对位相，而照片丢失了鬼线的位相信息。泽尔尼克这时正在从事统计物理学研究，就把这一问题放在心里，留待以后研究。 大约在1930年，泽尔尼克的实验室得到了一块大凹面光栅，安装在支架上准备使用。很快人们就看到了光栅表面的“伤痕”。由于光栅距人眼6m，看不清楚，泽尔尼克试着用一台小型望远镜观察它。这时不期而遇的事情发生了。线条状的伤痕看得非常清楚，可是当把望远镜精确聚集在镜面表面时，线条却消失无遗！怎么回事？泽尔尼克想起了10年前的思考，他意识到这一现象的重要意义，立刻集中精力研究这个光学问题。他借助于阿贝的成像理论，经过一系列实验和计算，终于作出了成功的解释。原来这是由于波的位相差所引起的干涉现象。1935年，泽尔尼克进一步根据位相理论研究出了位相反衬法，发明了相衬显微镜。在他的第一次设计中，使用一个直线条带样的孔径光阑，并在物镜的后焦面放置一个相应的直线条带光阑。泽尔尼克在他的诺贝尔领奖词中提到这一发明的偶然性时说：“然而，这个装置使物体结构的显微像显示了晕，因为衍射效应使物体细节的带状物像——沿垂直于带的方向散开，从而使像上的小亮点成为短线段状。为了避免这种观象，我改用了环状光阑，此光阑导致晕圈向各方向散开，不过晕圈变得很微弱以致实际上完全没有意义。” 现在全世界生产相衬显微镜的公司很多，相衬显微镜已经广泛应用于生物学及医学方面作细菌学和病理学的研究，也在矿物晶体微形貌学中得到了有效的应用。用这种特殊的显微镜，可以进行晶体表面生长的动态观察。 其实相衬显微镜就是我们平时所说的相差显微镜。它是根据光线通过不同密度的物质时，其滞留程度不同（密度大则滞留时间长）的原理设计的。 相差显微镜，可以将这种光程差或相位差，转换成振幅差，增强对比度。它与普通光学显微镜最主要的不同点是在物镜后装有一块相差板，由于相差板上部分区域有吸光物质，通过其的偏转光线之间又增加了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起了“夸大”作用。最后两组光线通过透镜会聚成一束，发生相互叠加或抵消的干涉现象，从而表现出肉眼明显可见的明暗差别。 由于反差是以样品的密度差别为基础形成的，故相差显微镜的样品不需染色，可观察活细胞，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。

[size=2][font=宋体]在光学显微镜的发展过程中，相衬镜检术的发明成功，是近代显微镜技术中的重要成就。[/font][/size][size=2][font=宋体]我们知道，人眼只能区分光波的波长（颜色）和振幅（亮度），对于无色通明的生物标本，当光线通过时，波长和振幅变化不大，在明场观察时很难观察到标本。相衬显微镜利用被检物体的光程之差进行镜检，也就是有效地利用光的干涉现象，将人眼不可分辨的相位差变为可分辨的振幅差，即使是无色透明的物质也可成为清晰可见。这大大便利了活体细胞的观察，因此相衬镜检法广泛应用于倒置显微镜中。[/font][/size][size=2][font=宋体]相衬镜检法在装置上与明场不同，有一些特殊要求：[/font][/size][size=2][font=宋体]a. 环状光阑（Ring slit）: 装在聚光镜的下方，而与聚光镜组合为一体---相衬聚光镜。它是由大小不同的环形光阑装在一圆盘内，外面标有10X、20X、40X、100X等字样，与相对应倍数的物镜配合使用。[/font][/size][size=2][font=宋体]b. 相板（Phase plate）: 装在物镜的后焦平面处，它分为两部分，一是通过直射光的部分，为半透明的环状，叫共轭面；另一是通过衍射光的部分，?quot 补偿面"。有相板的物镜称"相衬物镜"，外壳上常有"Ph"字样。[/font][/size][size=2][font=宋体]相衬镜检法是一种比较复杂的镜检方法，想要得到好的观察效果，显微镜的调试非常重要。[/font][/size][size=2][font=宋体]除此之外还应注意以下几个方面：[/font][/size][size=2][font=宋体]a. 光源要强，全部开启孔径光阑；[/font][/size][size=2][font=宋体]b. 使用滤色片，使光波近于单色[/font][/size]

相衬显微镜 摘要：本文详细介绍了相衬显微镜的光学结构、相衬装置、相衬原理、相衬显微分析的基本原理、相衬显微镜的操作以及其在金相分析中的应用。相衬显微镜是利用特殊相板的作用，使不同相位的反射光发生干涉或迭加，借以鉴别金相组织，又称“相差显微镜”。试样表面高度差大概在十埃到几百埃范围内均能清楚地被“相衬显微镜”所鉴别。 关键字：相衬显微镜、相衬原理、相衬装置 1. 相衬显微镜的光学结构 相衬显微镜的特点是在一般金相显微镜中加两个特殊的光学元件，在光源系统光阑的位置上，更换一块单环或同心双环遮板在物镜后焦面上放置一块相板，它是一块透明的玻璃片，在对应于圆环形遮板透光的狭缝处，真空喷镀两层不同物质的镀膜，称为“相环”，它起着移相合降低振幅的作用，当光线经遮板狭缝后形成环形光束射入显微镜，借助透镜调整遮板，使圆环狭缝正好聚焦在相板上，即使射入的环形光束与相板上的环状涂层完全吻合，为了调节方便，实际板上的环状涂层略大于狭缝的投影。 环形光束通过相环后经物镜投射在试样表面上，如果试样是一块平整光滑的磨面，那么反射光进入物镜光线必然与相环吻合，如果磨面有凸凹差别，，则不同部位的反射结果不同，凸出部分的反射光是直射光，经物镜后重又投在相环上，透过相环进入目镜，而凹陷部分的反射光包括直射光和衍射光两部分，直射光透过相环而衍射光则由各个方向进入物镜投射在相板的整个平面上，可见借遮板与相板的配合使反射光中的直射光裕衍射光在相板上通过不同的区域，即直射光通过相板上的相环部分，而衍射光则通过相板整个平面，通过和相环部分的直射光可借相环移相和降低振幅，达到提高衬度的效果。 2. 相衬装置 2.1 相板 相板是相衬显微镜中最重要的元件，它是一块圆形平面光学玻璃，在相环部位真空喷镀一层氟化镁，则通过相环部分的光线比通过其它部分的光线迟后一定位相，这就实现了移相，只要适当控制薄膜厚度，使相位刚好迟后π／２，这就是负相衬或明衬。如果镀膜加厚，使直射光迟后３π／２，这就是正相衬或暗衬。 除使直射光移相外，还需要降低振幅，使得迭加后的相衬效果更为明显，为此在相环上再喷镀一层银，使直射光通过镀银层振幅显著降低。 相板分为固定相板和活动相板，相板安置在物镜与垂直照明器之间，配有专用相衬物镜的相衬显微镜中，相板安置在物镜的后焦面上，但随着数值孔径的改变，相板与相环尺寸必须相应改变，才能得到正确的配合，因此每一物镜必须装有一个相应尺寸的相板，这种配有相板的专用物镜称相衬物镜，物镜上必须装有一个相应尺寸的相板，这种