乙酰异亮氨酸

一、摘要：1型糖尿病是一种会导致胰腺β细胞破坏的自身免疫性疾病，需要终身胰岛素治疗。胰岛移植提供了一个很有前途的解决方案，但也面临着诸如可用性有限和需要免疫抑制等挑战。诱导多能干细胞（iPSCs）为功能性β细胞提供了一个潜在的替代来源，并具有大规模生产的能力。然而，目前的分化方案，主要是在混合或2D环境中进行的，缺乏可延展性和悬浮培养的最佳条件。我们研究了一系列可能影响分化过程的生物反应器放大过程参数。该研究采用了一种优化的HD-DoE协议，该协议设计具有可扩展性，并在0.5L（PBS-0.5 Mini）垂直轮式生物反应器中实现。我们开发了一种三阶段的悬浮生长过程，从贴壁培养过渡到悬浮培养，TB2培养基在规模化过程中支持iPSC的生长。阶段性优化方法和延长分化时间用于增强iPSC衍生的胰岛样簇的标记物表达和成熟。连续的生物反应器运行被用于研究营养和生长的限制以及对分化的影响。将连续生物反应器与对照培养基变化生物反应器进行比较，显示出代谢变化和更类似b细胞的分化谱。从试验中收集的低温保存的聚集物被恢复，恢复后显示出活力和胰岛素分泌能力得到维持，这表明它们具有存储和未来移植治疗的潜力。本研究表明，阶段时间的增加或限制培养基补充以减少乳酸积累可以增加在大规模悬浮环境中培养的胰岛素合成细胞的分化能力。二、实验内容节选：营养消耗和代谢物的分析 为了检测细胞潜在的替代碳源和氮源，我们分析了对照组和连续生物反应器在整个培养过程中的氨基酸代谢（图S5A-B）。使用快速培养基氨基酸维生素分析仪Rebel（908 Devices）来分析氨基酸浓度。必需氨基酸，如组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸和缬氨酸在整个培养期间都保持不变。然而，一些氨基酸在两种培养基中都完全耗尽，包括5天后的L-天冬氨酸和16天后的L-谷氨酸。氨基酸代谢对正常的胰腺β细胞功能至关重要，丙氨酸和谷氨酰胺以其调节β细胞功能和胰岛素分泌的作用而闻名。在培养结束时，谷氨酰胺和丙氨酸的浓度高于新鲜培养基，表明它们不限制生长（图S5A-B）。然而，它们增加的来源仍然未知，不像之前的观察而将它们的增加归因于GlutaMAX&trade 添加剂。与起始培养基相比，丙氨酸和谷氨酰胺水平的升高在对照组生物反应器中没有观察到，后者在不同阶段之间和整个延长的内分泌诱导阶段都有频繁的培养基变化。两种生物反应器之间无其他显著性差异。如前所述，限制培养基补充的生物反应器比对照培养基变化的生物反应器具有更好的分化能力。氨基酸浓度调节和血清缺乏与促进来自人类干细胞的胰腺β细胞的发育有关。 此外，使用FLEX2（Nova Biomedical）对两种培养结果进行评估，分析两种反应器的整个培养期间Gln、Glu、NH4+、Na+、K+、Ca++、pH、PCO2和PO2（图S6A-B）。在连续生物反应器中，培养基的渗透压稳定增加，但保持在280-320mOsm/kg范围内。这种增加可以归因于由营养物质代谢和其他废物产生的溶质的积累。相比之下，对照培养基的渗透压变化的生物反应器随着培养基在细胞分化过程的不同阶段被补充而波动。谷氨酰胺和谷氨酸水平也进行了评估，两者都显示随着时间的推移而消耗。这与使用Rebel分析仪进行的测量结果一致。两种生物反应器在生物分化上具有可比性，除了在连续生物反应器中pH的持续下降和预期的耗氧速率方面的主要差异。在反应液中测量的气体可能会受到收集和测量之间时间的影响，但是，对所有样品的总体影响是相同的。总体数据显示，在培养10天或PP诱导分化阶段后，PO2水平开始稳步下降。尽管反应液与两个生物反应器顶空内的气体体积相同(500毫升），但与控制培养基补充变化生物反应器相比，进入反应液的氧气通量可能不足以补充0.5L连续容器中增加的耗氧量。文献来源：doi.org/10.21203

前文回顾（点击查看）：蛋白质测序技术发展漫谈（上篇）；蛋白质测序技术发展漫谈（中篇）前面讨论了基于质谱的蛋白质测序技术的一般流程及基于质谱的肽段序列测定方法。在组成蛋白质的20种氨基酸中，亮氨酸和异亮氨酸互为同分异构体，具有相同的分子质量，无法通过二级质谱产生的同系列离子的质量差异被区分。然而亮氨酸/异亮氨酸对单克隆抗体药物的功能影响巨大，典型的单克隆抗体在互补决定区（CDR）中含有至少3个亮氨酸/异亮氨酸，在复杂的样品中可以存在多达9个。单克隆抗体中CDR的错误识别，会导致抗原结合亲和力与抗体的特异性大量丧失。因此，对单克隆抗体中的全部亮氨酸或异亮氨酸进行准确测定意义重大[1-2]。亮氨酸和异亮氨酸的侧链分别是异丁基和仲丁基，通过质谱的多级碎裂产生的特征离子可以对亮氨酸和异亮氨酸进行区分。一种方法是通过不同系列的碎片离子质量差来区分，其原理是肽段在ETD-HCD或EThcD碎裂模式下可产生z离子，含有异亮氨酸和亮氨酸肽段分别失去一个乙基自由基（C2H5）和一个丙基自由基（C3H7），产生质量分别减少29 Da和43 Da的w离子，因此通过质谱产生的z/w离子质量差，可区分肽段中的亮氨酸和异亮氨酸[2-5]。Zhokhov[3]对人血清白蛋白（HSA）、gp188蛋白两种蛋白质的43条胰蛋白酶酶解肽段中的93个亮氨酸和异亮氨酸进行鉴定，准确区分了其中的83个，但由于z/w离子分别产生在ETD和HCD谱图中，在鉴定过程中需要人工筛选含有z/w离子的谱图。Tatiana[4]等通过EThcD的碎裂模式对蛙皮肤分泌的14条肽段进行鉴定，使肽段的z/w离子出现在同一张谱图中，区分鉴定了这些肽段中的61/75个亮氨酸和异亮氨酸。由于不能保证每个含有亮氨酸或异亮氨酸的肽段在质谱中碎裂一定会产生相应的z/w离子，因此通过z/w离子质量差的方法无法对蛋白序列中全部的亮氨酸和异亮氨酸准确测定。另一种方法是通过亮氨酸和异亮氨酸的亚胺离子的三级碎片离子区分，其原理是亮氨酸或异亮氨酸质子化的离子（132 Da）容易损失甲酸而形成相应的亚胺离子（86 Da），它们的亚胺离子在三级碎裂中分别会产生m/z 69和m/z 43的特征离子。Nakamura[6]使用嗜热菌蛋白酶对人钙降素进行酶解，得到以亮氨酸或异亮氨酸为N端的肽段，通过该方法确定钙降素的第4和9个氨基酸为亮氨酸，第27个氨基酸为异亮氨酸，但此方法的缺点是当一条肽段中含有不止一个亮氨酸或异亮氨酸时，特征离子峰相会互干扰，无法对其判断。Bagal[5]将亚胺离子的三级碎片离子的方法和z/w离子质量差的方法结合，并将该策略用于两个单克隆抗体CDR中的亮氨酸和异亮氨酸的鉴定，由于使用胰蛋白酶酶解产生的肽段长度过长，对鉴定造成影响，仅对6条肽段中的亮氨酸和异亮氨酸的准确鉴定，无法区分CRD区全部亮氨酸和异亮氨酸。Sheila[7]使用4种蛋白酶对单克隆抗体进行酶解，对二级质谱产生的a1离子进行三级碎裂，排除了肽段内部亮氨酸或异亮氨酸的干扰，根据每个三级谱图中特征峰强度的比值对亮氨酸和异亮氨酸区分，由于谱图中噪音干扰以及肽段的共碎裂，会使一些含有特征离子的谱图不能用于准确区分亮氨酸和异亮氨酸，最终对单克隆抗体中的71.1%-94.1%亮氨酸和异亮氨酸进行区分。我们借鉴该方法，结合非特异酶连续酶解技术，以及基于碎片离子质量校正和多谱图共同打分策略，实现了对单克隆抗体药物赫赛汀轻链中7个异亮氨酸和18个亮氨酸，重链中9个异亮氨酸和33个亮氨酸的鉴定，准确度100%，轻链鉴定的覆盖度为100%，重链鉴定的覆盖度为97.67%。鉴定蛋白质中亮氨酸和异亮氨酸的流程图[1] Hurtado P P, O' Connor P B. Differentiation of isomeric amino acid residues in proteins and peptides using mass spectrometry [J]. Mass Spectrom Rev, 2012, 31(6): 609-25.[2] Xiao Y, Vecchi M M, Wen D. Distinguishing between Leucine and Isoleucine by Integrated LC-MS Analysis Using an Orbitrap Fusion Mass Spectrometer [J]. Anal Chem, 2016, 88(21): 10757-66.[3] Zhokhov S S, Kovalyov S V, Samgina T Y, et al. An EThcD-Based Method for Discrimination of Leucine and IsoleucineResidues in Tryptic Peptides [J]. J Am Soc Mass Spectrom, 2017, 28(8): 1600-11.[4] Samgina T Y, Kovalev S V, Tolpina M D, et al. EThcD Discrimination of Isomeric Leucine/Isoleucine Residues in Sequencing of the Intact Skin Frog Peptides with Intramolecular Disulfide Bond [J]. J Am Soc Mass Spectrom, 2018, 29(5): 842-52.[5] Bagal D, Kast E, Cao P. Rapid Distinction of Leucine and Isoleucine in Monoclonal Antibodies Using Nanoflow LCMS(n) [J]. Anal Chem, 2017, 89(1): 720-7.[6] Nakamura T, Nagaki H, Ohki Y, et al. Differentiation of leucine and isoleucine residues in peptides by consecutive reaction mass spectrometry [J]. 1990, 62(3): 311-3.[7] Maibom-Thomsen S, Heissel S, Mortz E, et al. Discrimination of Isoleucine and Leucine by Dimethylation-Assisted MS3 [J]. Anal Chem, 2018, 90(15): 9055-9.作者简介：中国科学院大连化学物理研究所 单亦初副研究员1997年于中国科学技术大学获理学学士学位。2002年于中国科学院大连化物所获理学博士学位。2002年10月至2009年5月在德国马普协会马格德堡研究所、美国德克萨斯大学医学院及澳大利亚弗林德斯大学工作。2009年7月应聘到中国科学院大连化物所任副研究员。主持多项研究课题，包括国家重点研发计划子课题、国家自然科学基金面上项目等。已在Analytical Chemistry、Journal of Proteome Research、Journal of Chromatography A等杂志发表论文近80篇。主要研究方向包括蛋白质组鉴定和蛋白质组相对及绝对定量、蛋白质翻译后修饰富集和鉴定、蛋白质组末端肽富集和鉴定、蛋白质相互作用分析、蛋白质全序列从头测定及药物靶蛋白筛选。（本文经授权发布,仅供读者学习参考）专家约稿招募：若您有生命科学相关研究、技术、应用、经验等愿意以约稿形式共享，欢迎邮件投稿或沟通（邮箱：liuld@instrument.com.cn）。

近期，中科院合肥研究院智能所黄青研究员课题组利用红外和拉曼光谱识别赖氨酸乙酰化特征，为生物系统中蛋白质乙酰化结构分析提供了理论和实验基础。相关研究成果发表在国际光谱专业期刊Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy上。 乙酰化是生物学中常见且极其重要的蛋白质修饰，在细胞代谢中都起着关键性的调节作用。蛋白质乙酰化有两种方式，一是赖氨酸残基特有的乙酰化，二是多种氨基酸残基都可发生的N-末端乙酰化。目前一般用N-末端乙酰转移酶来标记判断赖氨酸残基是否发生乙酰化，但该方法的准确性仍存在争议。在分子水平识别蛋白质乙酰化是目前研究挑战之一，其关键是对赖氨酸的乙酰化进行准确定位表征，由此获得清晰和系统的认识。 针对这种情况，研究团队通过红外和拉曼光谱实验以及密度函数理论(DFT)计算，系统地研究L-赖氨酸三种乙酰化类型(、和)的结构变化及相应的振动光谱特征，发现酰胺基、羧基等基团的红外和拉曼特征谱带能用于有效识别不同的乙酰化类型。换言之，从红外和拉曼光谱特征即可判断赖氨酸是否乙酰化，也可判断赖氨酸发生了 乙酰化，还是 乙酰化，或者同时乙酰化。同时，研究团队对乙酰化的振动光谱识别策略在多肽模型中也得到验证。基于此，该项研究工作提供乙酰化赖氨酸的振动模式解析，并提出赖氨酸乙酰化的光谱识别和新的表征方法，为生物系统中蛋白质乙酰化结构分析提供了理论和实验基础。 　　该研究工作得到了国家自然科学基金和安徽省自然科学基金的资助。赖氨酸和三种乙酰化赖氨酸的分子结构Lys-G4多肽及其赖氨酸残基乙酰化的理论计算红外光谱(红色为乙酰基，蓝色为乙酰基)