二十烷五烯酸乙酯

编者注：傅若农教授生于1930年，1953年毕业于北京大学化学系，而后一直在北京理工大学(原北京工业学院)从事教学与科研工作。1958年，傅若农教授开始带领学生初步进入吸附柱色谱和气相色谱的探索 1966到1976年文化大革命的后期，傅若农教授在干校劳动的间隙，系统地阅读并翻译了两本气相色谱启蒙书，从此进入其后半生一直从事的事业——色谱研究。傅若农教授是我国老一辈色谱研究专家，见证了我国气相色谱研究的发展，为我国培养了众多色谱研究人才。 第一讲：傅若农讲述气相色谱技术发展历史及趋势第二讲：傅若农：从三家公司GC产品更迭看气相技术发展第三讲：傅若农：从国产气相产品看国内气相发展脉络及现状第四讲：傅若农：气相色谱固定液的前世今生第五讲：傅若农：气-固色谱的魅力第六讲：傅若农：PLOT气相色谱柱的诱惑力第七讲：傅若农：酒驾判官——顶空气相色谱的前世今生第八讲：傅若农：一扫而光——吹扫捕集-气相色谱的发展第九讲：傅若农：凌空一瞥洞察一切——神通广大的固相微萃取（SPME）第十讲：傅若农：悬“珠”济世——单液滴微萃取(SDME)的妙用第十一讲：傅若农：扭转乾坤——神奇的反应顶空气相色谱分析第十二讲：擒魔序曲——脂质组学研究中的样品处理第十三讲：离子液体柱——脂质组学中分离脂肪酸的气相色谱柱 上一讲我们主要介绍了在脂质组学中对脂肪酸的分析所用的离子液体毛细管色谱柱，但是用气相色谱分析脂肪酸源远流长，有许多故事，了解一些过去的故事对现在的发展理解有好处，温故才可以知新。　　先讲一下脂质组学中常常要研究的血浆分析，其中一个重要的项目是分析其中的脂肪酸，下面一个例子，概要介绍了血浆中脂肪酸的主要成分：　　“虽然游离脂肪酸只占血浆中脂肪酸的一小部分，但它代表一类高度代谢活性的脂质，脂肪组织是血浆游离脂肪酸的主要来源，其分布与食物的脂肪酸组成密切相关。在正常情况下从脂肪组织中释放脂肪酸与组织对能量的需要紧密相连。但是当代谢失调时，这种平衡被打乱，导致脂解增加，会释放出多于组织所需要脂肪酸的量。健康人经过一夜禁食后血浆中含有214 nmol/ml游离脂肪酸，油酸(18:1)的含量最高，其次是棕榈酸(16:0)和硬脂酸(18:0)，这三种酸占全部游离脂肪酸的78%。亚油酸(18:2)和花生四酸(20:4) 是主要的多不饱和脂肪酸(约占8%)。但是有营养作用的α-亚麻酸(18:3ω-3)，二十碳五烯酸(20:5, EPA)和二十二碳六烯酸(22:6, DHA)也占有一定比例，约为全部游离脂肪酸的1%。”1 脂肪酸气相色谱分析的历史故事　　气相色谱被认为是分析复杂混合物中脂肪酸的可靠方法，这一方法可追述到上世纪50年代，气相色谱的出现于脂肪酸的分析有密切的关系，1952年气相色谱发明人A. T. James 和 A. J. P. Martin就用最为原始的自制气相色谱仪分析小分子脂肪酸(Biochem J,1952,50:679),他们首次阐明气-液分配气相色谱的原理，设计了自动滴定检测脂肪酸的气相色谱仪。实验过程中使用的色谱柱为玻璃柱，其内径为4mm，长度为5英尺，固定相是把DC 550硅油涂渍在硅藻土Celite 545上。分离小分子脂肪酸的色谱如图1所示。 图1 用自动滴定计气相色谱仪分析小分子脂肪酸的色谱图　　分离从乙酸到戊酸的色谱如图2所示：图 2 分离从乙酸到戊酸的色谱　　此后分析脂肪酸的一个重大进步是把脂肪酸进行甲酯化，1956年James和Martin使用气体密度检测器，并把脂肪酸进行甲酯化，使用阿皮松类高温润滑脂作固定相，可以分离分子量大的脂肪酸。图3 是分离C5-C13直链和支链脂肪酸甲酯的色谱图。图 3 用高沸点润滑脂分离C5-C13直链和支链脂肪酸甲酯的色谱图色谱柱：在硅藻土载体上涂渍高沸点润滑脂；柱温：197℃；载气：氮气 14.1mL/min 色谱峰: (1) 空气, (2) n-戊酸甲酯，(3) n-己酸甲酯, (4) 4-甲基己酸甲酯,(5) 6-甲基庚酸甲酯, (6) n-辛酸甲酯, (7) 6-甲基辛酸甲酯, (8) n-壬酸甲酯,(9) 8-甲基壬酸酯, (10) n-癸酸酯, (11) 8-甲基癸酸酯, (12) 10-甲基十一酸酯 ,（13) n-十二酸酯, (14) 10-甲基十二酸酯2 脂肪酸气相色谱分析的发展　　脂肪酸的气相色谱分析由于它的极性和挥发性不好而带来麻烦，所以首先要把它的极性羰基转化成易于挥发的非极性衍生物。有多种烷基化试剂可以进行羰基的衍生化，使用最多的是进行甲基化，特别是使用氢火焰离子化监测器(FID)气相色谱时，尤为方便普及。但是使用FID也有一些不足之处。绝对的定量要依靠内标物的信号强度，经常使用的内标物是十七酸(而不是使用化学和物理性质与所测定脂肪酸相近的同位素标记脂肪酸混合物作内标)。人类体内不能合成奇数碳链的脂肪酸(包括碳17酸)，但是人们可以通过食物摄取它们，它们存在于血液的血浆中，增加内标物十七酸的量，从而扰乱定量分析。　　进一步讲，FID不能提供分子质量或其他结构特征信息，以便区分不同的脂肪酸，所以色谱和FID只是解决把所有要研究的脂肪酸分子完全分离开，用质谱解决脂肪酸的结构信息。大家应该知道使用电子轰击电离脂肪酸分子很容易被打成碎片，通过这些碎片可以进行脂肪酸的结构分析，但是灵敏度受到限制。弱电离技术比如负化学电离(NCI)可以改善检测限。使用卤代衍生化试剂可以进一步提高检测灵敏度，这种试剂增加了电子亲和力，可改善NCI-MS的灵敏度。Kawahara 使用五氟基苄(PFB) 作衍生化试剂来衍生化有机羧酸，这样的含氟衍生物电子很容易被俘获。此后这一方法扩展到脂肪酸的衍生化为脂肪酸酯，与脂肪酸甲酯相比，它很容易被NCI-MS检测。所以使用五氟基苄进行衍生化有利于提高检测灵敏度。许多研究者使用PFB做衍生化试剂进行脂质组学中的脂肪酸分析，例如Quehenberger等就是用这一方法分析巨噬细胞中的各种脂肪酸(Prostaglandins, Leukotrienesand Essential Fatty Acids，2008，79：123–129)。下图4 是分析巨噬细胞中的各种脂肪酸的色谱图。图 4 巨噬细胞中的各种脂肪酸的色谱图图中色谱峰的脂肪酸如下：(1)12:0 (2)14:0 (3)15:0 (4)16:1 (5)16:0 (6)17:1 (7)17:0 (8) a18:3 (9) 18:4 (10) g18:3 (11)18:2 (12)18:1 (13)18:0 (14)20:4 (15)20:5 (16)11,14,17–20:3 (17)bishomo-20:3 (18)20:2 (19)5,8,11–20:3 (20)20:0 (21)22:6 (22)22:4 (23)22:5 (24)22:2 (25)22:3 (26)22:1 (27)22:0 (28) 23:0 (29)24:1 (30)24:0 3 国内外进行气相色谱分析脂肪酸的一些例证　　 为了进一步了解进行气相色谱分析脂肪酸的具体情况，下面表1列出近50例分析各种样品中脂肪酸的色谱柱和分离对象。表2列出国外文献中分析人体组织中脂肪酸的例证。表 1 国内气相色谱分析脂肪酸的色谱柱和分析对象 表 2 国外文献中有关分析人体组织中脂肪酸的衍生化方法和所用色谱柱4 脂肪酸气相色谱分析所用色谱柱　　从已发表的文献看分析整体脂肪酸需用非极性的聚硅氧烷毛细管色谱柱，如聚二甲基硅氧烷，分离多不饱和脂肪酸需用极性强的色谱柱，如OV-275，OV-275(这是聚硅氧烷固定相中极性最强的色谱柱)和CP-Sil 88(HP-88)。 据安捷伦公司一份研究报告(5989-3760 EN)，他们对最重要的一些脂肪酸(甲酯)(见表3)进行研究，研究总结认为：聚乙二醇柱对不太复杂的样品可以得到很好的分离 而中等极性的氰丙基聚硅氧烷柱(DB 23)对复杂的 FAMEs 样品可以得到很好的分离，对一些顺反异构体也可以得到分离 要使顺反异构体分离的更好，就要使用更高极性的 HP-88 氰丙基色谱柱。表3 重要的一些脂肪酸　　三种主要色谱柱分离脂肪酸的特点如下：　　使用DB-Wax柱，DB-23 柱和HP-88 柱上分离37种脂肪酸混合物的色谱见图5-图7.图 5 FAMEs在30 m 0.25 mm ID, 0.25 μm DB-Wax 色谱柱上的色谱图 6 FAMEs混合物在 60 m 0.25 mm ID, 0.15 μm DB-23 柱上的色谱图 7 FAMEs 混合物 在 100 m 0.25 mm ID, 0.2 μm HP-88 柱上 的色谱　　其中HP-88 柱的极性最强，是含88%氰丙基甲基聚硅氧烷，其结构如下图8：图8 HP-88 的分子结构　　HP-88 对一些异构体的分离能力由于DB-23如下图9所示　　图 8 HP-88和HP-23分离能力的差别　　(此图来自Walter Jennings博士2008年在北京大学作报告时的ppt文稿)　　吴惠勤等使用P-88毛细管色谱柱分离了39种脂肪酸得到的质谱基峰离子和特征离子如表4中的数据。表4 39种脂肪酸在HP-88毛细管色谱柱上出峰次序( 吴惠勤等，分析化学，2007，35(7)：998-1003)

导读2021年12月3日，国家医疗保障局召开新闻发布会公布2021年国家医保药品目录调整结果，于2022年1月1日正式执行。治疗罕见病脊髓性肌萎缩症（SMA）的药物诺西那生钠注射液被纳入医保，价格从曾经的70万一针降至3.3万，为患者及其家庭带来福音。SMA是一种罕见的遗传性神经肌肉疾病，是由于SMN1基因突变或缺失，造成与运动神经元密切相关的SMN蛋白缺乏，导致肌肉萎缩，大部分患者因为呼吸衰竭而死亡。诺西那生钠的有效成分是一种反义寡核苷酸，可以改变SMN2前mRNA的剪接，增加完整长度SMN蛋白的产生，达到治病的目的。什么是寡核苷酸药物？寡核苷酸药物通常指由人工合成的长度50个以内核苷酸组成的一类药物，包含单链或双链DNA或RNA。目前研究较多的是反义寡核苷酸药物（ASO）和小干扰RNA药物(siRNA)。与小分子药物和单抗药物靶向蛋白质不同，寡核苷酸药物通常靶向mRNA，从转录后水平进行治疗，具有特异性好、有效性高和长效性突出的优势。寡核苷酸药物分析和表征为了保证产品的安全性和有效性，寡核苷酸药物通常需要从分子量、碱基序列、解链温度Tm、产品纯度、有关物质等方面进行分析，需要使用质谱、生物惰性液相色谱、紫外分光光度计等仪器，岛津公司开发了一系列的解决方案，供您参考。分子量表征寡核苷酸药物通常使用固相亚磷酰胺化学法进行合成，亚磷酰胺单体是合成的关键原料。寡核苷酸药物的分子量则是其重要的产品属性。因此，检测寡核苷酸药物及其合成用原料亚磷酰胺单体的分子量是常用的质量控制手段。常用的分子量检测方法是质谱法。岛津质谱产品四极杆飞行时间质谱仪（LCMS-9030）、单四极杆质谱仪（LCMS-2050）和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-8030）都是寡核苷酸药物及其原料分子量表征的常用仪器。下面就为大家带来QTOF LCMS-9030测定寡核苷酸药物精确分子量和MALDI-8030测定亚磷酰胺单体分子量的精彩案例。• LCMS-9030分析寡核苷酸药物分子量岛津四极杆飞行时间质谱 LCMS-9030具有高分辨率、高质量数准确度和媲美三重四极杆灵敏度的特点，可以准确测定寡核苷酸分子量。寡核苷酸分子带负电，通常使用ESI负离子模式检测，在质谱图上常观测到一系列的多电荷离子，需要进行解卷积处理，得到寡核苷酸分子量。LCMS-9030结合Insight Explore CSD分析结果寡核苷酸药物序列: 5' -mG-mC*-mC*-mU*-mC*-dA-dG-dT-dC*-dT-dG-dC*-dT-dT-dC*-mG-mC*-mA-mC*-mC*-3' 理论单同位素分子量：6431.7239采用QTOF LCMS-9030采集一个长度为20 mer的寡核苷酸药物的高分辨质谱图，使用Insight Explore CSD进行解卷积处理，得到实测单同位素分子量为6431.7236，质量数偏差为0.05 ppm。• MALDI-8030分析亚磷酰胺单体的分子量采用MALDI-8030测定了四种亚磷酰胺单体的分子量，在线性正离子模式下，均检测到显著质谱峰，质荷比大小与钾离子加合峰相符。MALDI-8030体积紧凑、分析速度快、维护方便，是寡核苷酸样品分析的有力工具。序列确认寡核苷酸的序列同设计序列一致，是保证药物有效性的重要方面。采用MALDI-8030测定了长度为20 mer的一种寡核苷酸的分子量和碱基序列。寡核苷酸的MADLI-TOF质谱图主要以单电荷和双电荷形式存在，可直接读出分子量，操作简单，结果直观。利用源内裂解技术（ISD），寡核苷酸更倾向于形成w型碎裂离子，碎裂离子谱图更简单。通过比对这些碎片离子信息，可以较容易地读出核酸序列。寡核苷酸MALDI-ISD-TOF质谱图和碎裂离子解链温度（Tm）随着温度升高，双链核酸分子的双链结构开始打开，最终变成两条单链的结构。Tm是双链核酸分子双链结构解开一半时的温度，是双链核酸分子结构稳定性的重要指标。使用岛津UV Tm分析系统可以非常方便地测定双链核酸分子的Tm。该系统由紫外分光光度计、电热温度控制单元和Tm分析软件组成。Tm分析软件可以控制温度控制单元准确控温，升温速率12档可调，可满足双链核酸分子解链曲线的连续测定。Tm分析软件还可以自动分析解链曲线，给出准确的Tm数值。UV Tm分析系统组成（左）和核酸样品Tm分析结果（右）纯度分析使用生物惰性液相Nexera XS Inert结合Shim-pack Scepter C18色谱柱进行了寡核苷酸样品的快速纯度分析，寡核苷酸和其杂质分离良好。即使在50℃高温、0.1M TEAA的盐浓度条件下分析，也表现出良好的稳定性。基于有机杂化颗粒硅胶技术的Shim-pack Scepter C18，适合用于寡核苷酸纯度以及杂质分析。12 mer寡核苷酸样品纯度分析UHPLC色谱图递送介质分析递送介质是将核酸药物递送至靶组织，穿透细胞膜，进入细胞内部发挥药效的关键。脂质纳米粒（LNP）和聚乙烯亚胺（PEI）都是核酸药物的常用递送介质。LNP通常包含阳离子脂质、胆固醇、PEG修饰脂质和辅助性中性脂质，四种成分协同作用，将寡核苷酸包裹并递送到细胞内发挥作用。PEI是一种水溶性高分子聚合物，携带大量正电荷，可通过静电作用结合核酸药物，将其递送至细胞内，并保护其免受核酸酶降解。递送介质的含量检测对寡核苷酸药物给药方式、药学研究等具有重要意义。利用岛津生物惰性液相系统结合蒸发光散射检测器ELSD-LT III建立了定量分析LNP中四种成分含量，以及PEI含量的分析方法。结语天价寡核苷酸药物首进医保，使得这类药物在近期迅速刷屏，备受关注。对寡核苷酸药物进行分析和表征，可以更好地保证产品的药效和安全性。基于岛津丰富的分析仪器产品线，我们利用QTOF LCMS-9030、单四极杆质谱LCMS-2050、MALDI TOF质谱、UHPLC、UV Tm分析系统等技术平台，开发了分子量表征、核苷酸序列确认、Tm测定、纯度分析和递送介质分析的方法，助力寡核苷酸药物研发和质控，希望未来开发出更多更好的药物，造福患者。本文内容非商业广告，仅供专业人士参考。

1. 技术背景图1. 晶体硅太阳能电池结构晶体硅太阳能电池结构由钢化玻璃板/EVA膜/太阳能电池板/EVA膜/背板构成，如图1所示。其中，太阳能电池封装用EVA是以乙烯/醋酸乙烯共聚物（醋酸乙烯含量为30%-33%）为基料，辅以数种改性剂，经成膜设备热轧成薄膜型产品，厚度约0.4 mm。封装过程中EVA受热，交联剂（通常为过氧化物）分解产生自由基，引发EVA分子之间的结合，形成三维网状结构，导致EVA胶层交联固化，交联机理如图2 所示。固化后的胶膜具有相当高的透光率、粘接强度、热稳定性、气密性及耐老化性能。图2. EVA加热过程中在交联剂过氧化物下的交联机理EVA固化不足可直接导致光伏组件在其近20年的使用中性能恶化，这将意味着重大的经济风险。因此为实现经济有效的层压，快速可靠的EVA交联度分析方法至关重要。以往的化学法测交联度耗时长（30小时左右），结果重复性差，并且使用有毒的溶剂（甲苯或二甲苯），无法准确测试较低交联度和较高交联度的EVA。根据国家标准：1）GB/T 29848-2018：光伏组件封装用乙烯-醋酸乙烯酯共聚物（EVA）胶膜2）GB/T 36965-2018：光伏组件用乙烯-醋酸乙烯共聚物交联度测试方法--差示扫描量热法（DSC）采用差示扫描量热法（DSC）是目前较为可靠的分析方法，应用DSC测定光伏组件在层压过程中已交联的EVA的交联度，仅需1小时时间即可获得重复性良好的结果，是一种快速简便的产品质量控制方法。2.方法设计1）DSC：称取未交联和交联EVA样品5~10mg至40μL铝坩埚内，以10 K/min从−60℃加热到250°C，后以20 K/min的速度从250℃冷却至-60℃，再以10 K/min进行第二次升温，全程惰性氩气氛围。交联EVA的交联度可由以下方程计算获得：梅特勒-托利多差示扫描量热仪 DSC2）此外，醋酸乙烯组分的分解机理如下所示：根据上述计算公式，可通过热重法（TGA）分析计算得到EVA中VA的百分含量，从而帮助对EVA来料进行质检，以判定EVA的优劣。TGA/DSC：称取优质和劣质的交联EVA样品至陶瓷坩埚内，以10 K/min从30℃加热到600°C，全程惰性氩气氛围。3.数据分析1）DSC分析计算EVA的交联度图3为未交联EVA样品的升降升循环DSC测试曲线。在第一次升温曲线上可观察到明显的三个热效应，从低温至高温，依次是未交联EVA的玻璃化转变、结晶部分的熔融以及高温处的固化交联放热峰，所呈现的固化放热焓值为ΔH1（17.49 J/g）。由第二次升温曲线在高温处所表现处的平直基线可以得出结论，ΔH1为未交联EVA完全固化所释放出的热焓。图3. 未交联EVA样品的DSC测试曲线图4为交联EVA样品的DSC第一次升温曲线，第二次升温在高温处同样为平直的基线，故未呈现。温度从室温开始，可观察到结晶部分的熔融以及高温处的后固化交联放热峰，所呈现的后固化放热焓值为ΔH2（8.47 J/g）。因此，该交联EVA样品的交联度根据上述计算公式为51.55%。图4. 交联EVA样品的DSC第一次升温曲线1）TGA分析计算EVA中VA的百分含量图5为优质与劣质EVA的TGA/DSC测试曲线。根据EVA的分解机理，TGA曲线上的第一个失重台阶为醋酸乙烯分解产生醋酸的过程，因此失重量为醋酸的质量。第二个失重台阶为EVA中原有的乙烯组分和醋酸乙烯分解产生的乙烯的分解。因此，EVA中醋酸乙烯的含量可由第一个失重台阶即醋酸的失重百分含量的1.43倍计算而得。如图所示，优质EVA的VA含量为29.5%（太阳能电池封装用EVA的醋酸乙烯含量为30-33%），劣质EVA的VA含量仅为16.6%。与此同时，同步的DSC曲线上亦可找到相关判断依据。由于劣质EVA含有更高含量的乙烯组分，因此其结晶能力更强，所呈现的结晶熔融过程表现在更高的温度范围。图5. 优质与劣质EVA的TGA/DSC测试曲线4.小结由此可见，光伏组件封装用EVA胶膜的相关热性能的鉴定可由DSC、TGA或同步热分析TGA/DSC快速给出判断依据。此外，工艺上EVA固化通常采用层压实现，而层压的温度和时间作如何优化可由DSC动力学模块给出科学且精准的预测，为层压工艺提供数据和理论指导。