甲基补骨脂黄酮

国家标准计划《香柠檬、柠檬、苦橙和白柠檬精油(已全部除去或部分降低5-甲氧基补骨脂素)中5-甲氧基补骨脂素含量的测定 高效液相色谱法》由 TC257（全国香料香精化妆品标准化技术委员会）归口，TC257SC1（全国香料香精化妆品标准化技术委员会香料香精分会）执行 ，主管部门为中国轻工业联合会。主要起草单位 上海香料研究所有限公司等 。附件：征求意见稿编制说明

“天然的保肝药” 都是怎么来的？水飞蓟素被成为“天然的保肝药”，是从菊科植物水飞蓟的干燥果实中提取而得到的一种黄酮木脂素类化合物。该类化合物具有清除自由基，抗脂质过氧化，保护肝细胞膜，促进肝细胞修复再生，抗肝纤维化，降血脂等效果。黄酮类化合物（flavonoids），原是指以2-苯基色原酮为骨架衍生的一类化合物的总称。现泛指两个苯环通过三个碳原子相互连接而成的一系列化合物的总称，即具有C6-C3-C6结构的一类化合物的总称。大量研究表明黄酮类化合物还具有降压、降血脂、抗衰老、提高机体免疫力、泻下、镇咳、祛痰、解痉及抗变态等药理活性。1介绍本文中将会介绍一种简便、可靠的方法，用来测定金盏菊中黄酮类化合物含量的应用。黄酮类化合物是多酚类次生代谢产物，对人体的生物利用度较低。一旦被吸收，黄酮类化合物被迅速代谢，产生具有抗炎、氧化、血栓形成、糖尿病和癌症特性的代谢物。黄酮类化合物存在于水果，蔬菜，谷物，树皮，根茎，花茶和葡萄酒中。在本文中，金盏菊粉末通过使用全频固液萃取仪 E-800 用索氏热萃取法提取，用紫外分光光度法测定黄酮类化合物的含量。2设备固液萃取仪 E-800 pro分析天平(精度 ±0.1mg)紫外/可见分光光度计(PerkinElmer Lambda 25)3样品和试剂样品：含花萼的金盏菊干粉，参考黄酮类含量：0.29%试剂：丙酮，六水氯化铝，甲醇 HPLC，六亚甲基四胺纯化物，无水硫酸钠，去离子水4实验流程黄酮类含量的测定包括以下步骤:分别用丙酮和酸水解同时提取和分解，形成黄酮类苷。黄酮类苷以结合态（黄酮苷）或自由态（黄酮苷元）形式存在，乙酸乙酯液液萃取黄酮类苷元，紫外/可见分光光度法测定黄酮类含量。1. 样品制备将萃取纸滤筒放入索氏萃取腔中称取 0.8g 均质样品到纸滤筒中在样品上加入 1.0mL 试剂在纸滤筒内加入 7.0mL 盐酸（浓度37%)2. 使用表1中参数设置用 E-800 进行提取表1：UniversalExtractor E-800 的索氏热萃取参数步骤_加热等级萃取方法索氏热萃取_溶剂丙酮_萃取10 cycles样品杯:11萃取腔: 3淋洗5 min11干燥AP, 2 min11溶剂体积 [mL]100_3. 液液萃取将提取液转移到 100ml 的容瓶中。将所得溶液 20ml 转移到分离漏斗中，加入 20ml 去离子水，用乙酸乙酯洗涤溶液，进行液-液萃取。收集有机相用 2x50mL 去离子水洗涤，用无水硫酸钠干燥后过滤有机相，将液体直接转移到 50ml 容量烧瓶中。4. UV / Vis分光光度法试验溶液:取 10.0 mL 原液，加入 1mL 氯化铝试剂，用 5% 冰醋酸在甲醇中稀释至 25.0mL。30 分钟后，测定测试溶液的吸光度，并在 425nm 处进行比较。5. 计算以金丝桃苷表示的黄酮百分比含量按式计算。金丝桃苷的吸光度为 500 (1%，d=1cm)5结果金盏菊样品被分成三份分析。测定的黄酮类化合物含量与参考值 0.29% 吻合较好。由于黄酮类化合物含量低，小的偏差导致较高的相对标准偏差。因此，定义了 5% 的相对标准偏差。结果如表2所示。表2:金盏菊提取物类黄酮含量测定结果6结论采用全频固液萃取仪 E-800 对金盏菊粉末中黄酮类化合物的含量进行测定，结果可靠，重复性好。与文献中描述的方法进行了比较。省略了提取过程中的费力步骤，获得更高的黄酮类化合物含量，残留损失较少，使用全自动萃取仪成功完成实验。步琦助力研究人员进行各类天然产物的提取与分析，提供更高效便捷、更人性化、更对自然友好的解决方案。▲E-800萃取仪7参考文献https://lpi.oregonstate.edu/mic/dietary-factors/phytochemicals/flavonoids#metabolism-bioavailability, 17.12.2020Chen A., Xiang W., Liu D., Liu C., Yang L., Determination of Total Flavonoids and ItsAntioxidant Ability in Houttuynia cordata, Complementary medicine researchJournal of Materials Science and Chemical Engineering, 4, 131-136, 2016.Williams R. J., Spencer J. P, Rice-Evans C., Flavonoids: antioxidants or signaling molecules?, Free Radical Biology and Medicine, 36, 838-849, 2004.Ph. Eur. Monograph on Caldendulae flos, 07/09:3000, corrected 10.1

中药资源丰富，历史悠久，在预防与治疗疾病中扮演着重要的角色。然而，中药的化学成分多种多样，作用机制更是复杂多样，如何从中药中筛选疾病相关药效物质是当前亟待解决的关键问题。大量研究表明，人体许多疾病过程都与体内生物酶调节作用相关，如痛风[1]、阿尔茨海默症[2]、糖尿病[3-5]等。而且，中药在治疗各种疾病中也扮演着重要角色，如白芷提取物能促进新生血管形成与成熟，从而提高自发2型糖尿病小鼠创面愈合速率和质量[6]；绞股蓝叶水提物能够降低链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的血糖，其作用机制可能与增加骨骼肌肌膜葡萄糖转运体4蛋白表达和抑制骨骼肌炎症有关[7]。因此，基于酶在疾病发生发展的重要性，以酶为靶点从中药中筛选新药是一有力途径，而且开发一种快速、高效的酶抑制剂筛选方法是当前首要任务。固定化酶技术是20世纪60年代发展起来的，该技术利用物理或化学方法将游离酶固定在相应的载体上用于筛选酶抑制剂。固定化酶技术可以有效提高酶的催化性能和操作稳定性，并降低成本，是目前广泛使用的技术[8]。此外，相比于游离酶，固定酶更有利于酶-配合物的分离纯化，在pH耐受性，底物选择性，热稳定性和可回收性等方面表现出优越的性能[9-10]。不同的酶发挥催化作用的活性部位不同，将酶进行固定时，要使载体材料与酶的非活性部位结合，才可以保留酶的活性，因此载体材料的选择是固定化酶技术发挥作用的关键。本文以固定载体材料（表1）为分类综述了近10年固定化酶技术在中药酶抑制剂[α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，α-Glu）、脂肪酶等] 筛选中的研究现状，希望可以为后续的相关研究提供一定的参考依据。1 磁性载体磁性载体材料是利用铁、锰、钴及其氧化物等化合物制备的一类具有磁性的材料[11]，通过改变磁力大小和外部磁场的方向来改变粒子的运动轨迹，从而使酶与载体的结合与分离可以在可控条件下完成，便于固定化酶的分离和收集，并用于酶抑制剂的筛选[12]。以磁性载体为材料的固定化酶技术的最大优点在于利用磁力吸引可使固定化酶快速从反应体系中分离，且固定化方法简单，能有效减少筛选时间及实验试剂的消耗。因此，通过不同方法对磁性载体材料进行功能化修饰，在充分发挥磁性材料优势的基础上改善其表面性质，提高对不同类型目标物的特异性，从而在各类复杂样品的前处理过程中有着良好的应用潜力[13]。目前，磁珠是近年来发展起来的一种常用的磁性载体材料，也叫做磁性纳米粒子，包括氧化铁（Fe3O4和γFe2O3）、合金（CoPt3和FePt）等。其中，Fe3O4纳米粒子具有生物相容性和无毒性等优点，被广泛应用于酶的固定化。中药酶抑制剂筛选中的常用磁珠其磁核以Fe3O4纳米粒子为主，壳层为二氧化硅、琼脂糖、葡聚糖等，是具有超顺磁性的小球形磁性粒子[14-15]，可借助外部磁场从生物催化体系中分离酶抑制剂。该方法机械稳定性高、孔隙率低，利于降低反应中的传质阻力，提高了固定化酶的重复使用性。由于其具有操作稳定性高、磁响应强、磁分离速度快等优点，在生物和药物研究中得到了广泛的应用[16]。在进行酶抑制剂筛选时，磁珠的修饰位置不同，所固定的位点也不同。因此，在实验中，往往要根据靶蛋白的分子结构选择合适的磁珠或将某一磁珠进行修饰后作为固定载体。将酶固定在合适的磁珠上会增强酶与待筛选酶抑制剂的亲和力，利用磁力将固定化酶及其抑制剂从提取液中分离，然后洗去与酶不相互作用的化合物，随后可得到酶固定化磁珠配体配合物，最后通过洗脱溶剂使配体释放进而通过质谱表征[17]。在这种方法中，潜在的配体与酶相互作用，生成酶配体配合物，这有利于利用磁性[18-23]从复杂混合物中分离活性化合物。在酶抑制剂的筛选中，磁性载体材料是最常用的固定化载体材料[24-30]。1.1 无机载体材料二氧化硅是磁性纳米粒子表面修饰最常用的无机材料[23,31-34]，此外还有二氧化钛[35]、介孔二氧化硅[16]等。Li等[23]首先将Fe3O4分散在水中加入聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）室温搅拌得到产物。然后在超声作用下将产物分散在含有异丙醇和氨水的混合溶剂中，室温搅拌下缓慢加入正硅酸乙酯（tetraethylorthosilicate，TEOS）溶液得到SiO2@Fe3O4磁性微球，并加入3-氨丙基三甲氧基硅烷（3-aminopropyltrimethoxysilane，ATPES）对其表面进行改性。最后将α-淀粉酶固定在表面改性的SiO2@Fe3O4磁性微球上。将制得的酶固定化磁性微球用于黄花草中α-淀粉酶抑制剂的筛选，最终得到3种黄酮类化合物对α-淀粉酶具有较好抑制作用。Liu等[35]采用溶剂热法（也称水热法或水热合成法）制备了Fe3O4@TiO2纳米粒子，并通过静电相互作用固定脂肪酶。采用透射电镜、傅里叶变换红外光谱和X射线衍射等方法对磁性纳米粒子进行表征，以确定脂肪酶是否已经被固定。研究中应用脂肪酶固定化Fe3O4@TiO2纳米粒子从6种具有脂肪酶抑制活性的藏药中筛选出脂肪酶抑制剂，获得5种具有与临床常用减肥药物奥利司他活性类似的化合物，其中1种化合物（山柰酚）的抑制活性优于奥利司他。Yi等[16]将谷胱甘肽S-转移酶固定在介孔二氧化硅磁性微球表面筛选紫苏中的酶抑制剂，利用高效液相色谱和四极飞行时间质谱法进行鉴定，筛选出6种具有谷胱甘肽S-转移酶抑制作用的物质，其中，迷迭香酸、(−)表没食子儿茶素-3-没食子酸酯和 (−)-表儿茶素-3-没食子酸酯具有较好的抑制活性。最后利用分子对接技术确定潜在抑制剂与谷胱甘肽S-转移酶的结合方式。首先，用FeCl3与柠檬酸三钠和乙酸钠合成Fe3O4，然后将其分散在含有乙醇、去离子水和氨水的混合溶液中，搅拌均匀后加入TEOS制得SiO2@Fe3O4磁性微球。为进一步合成介孔二氧化硅磁性微球（mSiO2@SiO2@Fe3O4），将SiO2@Fe3O4磁性微球分散在十六烷基三甲基氯化铵、去离子水和三乙醇胺中并滴加TEOS，产物用磁铁分离并清洗除杂后得mSiO2@SiO2@Fe3O4磁性微球。最后用PDA对mSiO2@SiO2@Fe3O4磁性微球进行表面改性并将谷胱甘肽S-转移酶固定在其表面。1.2 有机载体材料在酶抑制剂的筛选中，有机载体材料相比于无机载体材料应用较少。目前，用于磁性纳米粒子表面修饰的有机载体材料有聚酰胺（polyamidoamine，PAMAM）[36]、共轭-有机骨架[37]和金属-有机骨架[38]等。Jiang等[36]以PAMAM包覆磁性微球为基础，建立了一种筛选和鉴定赤芍提取物中α-Glu抑制剂的方法。首先，采用微修饰法合成了Fe3O4-COOH微球。然后，通过Fe3O4-COOH微球表面羧基与PAMAM氨基的偶联反应，制备了Fe3O4@PAMAM微球。最后，通过GA的交联，成功地将α-Glu连接到其表面。结果表明，没食子酸和(+)-儿茶素对α-Glu均具有较好抑制作用。Zhao等[37]将乙酰胆碱酯酶（acetylcholinesterase,AchE）固定在适配体功能化磁性纳米颗粒共轭有机骨架上构建固定化酶反应器，并将该方法用于酒石酸、(−)-石杉碱A、多奈哌齐和小檗碱4种AchE抑制剂抑制活性的测定，发现酒石酸的IC50与已报道的结果相当，证明了该固定化酶反应器的可行性。Wu等[38]将α-Glu固定在磁性纳米材料Fe3O4@ZIF-67上，构建了快速筛选α-Glu抑制剂的生物微反应器。然后，将酶生物微反应器通过外加磁场固定在连接高效液相色谱仪（high performance liquid chromatography，HPLC）和微注射泵2端的管中，形成一个磁性在线筛选系统。以信阳毛尖粗茶提取物为实验对象，对该在线筛选方法进行验证，利用该在线筛选系统筛选出3种抑制剂（儿茶素、表没食子儿茶素没食子酸酯和表没食子酸酯）。与传统方法相比，该方法可将筛选、洗脱和分析结合起来，可以简单、高效、直接地从天然来源筛选和鉴定潜在的α-Glu抑制剂。磁珠分散性好，磁分离速度快，酶结合量大，酶活性高，是固定化酶的理想载体，现已广泛应用于酶抑制剂的筛选中。将酶固定在特定的磁珠上，可实现酶抑制剂的分离。此方法操作较稳定，非特异性结合率低。因此，酶固定化磁珠技术因其快速的生物分析、导向性分离和从复杂混合物中直接捕获配体而受到越来越多的关注。2 非磁性载体2.1 无机载体材料2.1.1 石英毛细管 毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）具有分离效率高、分析速度快、操作简单和样品消耗少以及可与多种检测手段联用等优点，在酶分析研究中越来越受到关注[39-41]。近年来，固定化酶微反应器与生物活性靶向技术相结合已应用于中药酶抑制剂的筛选[42]。该方法将酶固定在经过修饰的石英毛细管内，捕获抑制剂后，洗涤未结合组分，进而通过蛋白质变性洗脱活性结合配体，允许直接并可重复注射生物样品到高效液相色谱上进行检测，筛选和分离一步完成，大大缩短了操作时间。但该方法制备过程中是比较复杂繁琐的[43-44]，而且载体的孔隙率[45]、孔径[46]和表面化学[47-48]等因素也很容易影响固定化酶的性能。Wu等[49-50]用PDA对石英毛细管进行表面改性，并与氧化石墨烯共聚形成聚多巴胺/氧化石墨烯涂层，增加了固定化酶的结合率，并将该方法成功用于凝血酶和凝血因子Xa以及黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选。有研究者用3-氨基丙基三乙氧基硅烷对石英毛细管进行表面改性，采用戊二醛交联法进行酶的固定，并成功用于酶制剂的筛选。Rodrigues等[51]将此修饰方法用于黄嘌呤氧化酶（xanthine oxidase，XOD）抑制剂的筛选，成功地从不同天然产物中筛选出30个潜在的XOD抑制剂。Zhang等[52]将此修饰方法用于组织蛋白酶B抑制剂筛选，并从中药中发现了17个具有抑菌潜力的活性成分，发现山柰酚等5种天然产物有潜在的抑制作用，并以分子对接进行验证。Tang等[53]将此修饰方法用于脂肪酶抑制剂的在线筛选，结果发现6种天然产物对脂肪酶活性均有抑制作用。Zhao等[54]将此修饰方法用于神经氨酸酶抑制剂的筛选，发现了6种天然产物为潜在抑制剂。进一步测定了这6种化合物对神经氨酸酶潜在的抑制活性，由大到小分别为：甲基补骨脂黄酮A＞补骨脂甲素＞黄芩素＞黄芩苷＞白杨素和牡荆素。此外，还有研究者采用单片毛细管固定化酶反应器与液相色谱-串联质谱联用技术，成功用于酶抑制剂的筛选[55-56]。毛细管的高表面体积比有利于足够高浓度的酶用于酶促反应[57-58]。此外，由于注入的底物溶液直接与固定化酶分子接触，使传统的采样、反应、分离和检测多步操作简化为一步操作，因此该分析变得更简单，不需要额外的混合程序。与磁性载体相比，该技术将筛选和分离集成为一步，大大缩短了操作时间。该技术适用于复杂混合物中酶抑制剂的快速筛选，而且样品消耗量少，节省了试剂成本，可以实现酶抑制剂的快速分离。2.1.2 硅酸铝纳米管 硅酸铝纳米管（halloysite nanotubes，HNTs）是一种天然存在的硅酸盐纳米管，由于其优异的物理特性，引起了人们越来越多的兴趣。HNTs的内径为20～30 nm，外径为30～50 nm，长度为1～2 µm，为药物、酶和杀菌剂的储存提供了理想的纳米级包埋系统。更重要的是，HNTs的外表面主要由O-Si-O基团组成，内表面由Al2O3组成，为酶提供了更多的选择性结合位点，从而减少了配体在HNTs上的非特异性吸附[59]。因此，有研究者将HNTs作为一种新的酶固定载体材料用于酶抑制剂的筛选。Wang等[59]通过静电吸附作用将脂肪酶固定到羟基纳米管上用于厚朴中脂肪酶抑制剂的筛选，发现厚朴三酚和厚朴醛B 2种化合物对脂肪酶抑制活性较好。HNTs的内外表面为酶提供了更多的选择性结合位点，降低了非特异性吸附，但其合成较为复杂，收率较低，因此应用有限。2.1.3 多孔二氧化硅 多孔二氧化硅材料具有表面张力低、粘温系数小、压缩性高、气体渗透性高等基本性质，同时还具有耐高温和低温、电气绝缘、耐氧化稳定性、耐候性、难燃、耐腐蚀、无毒无味以及生理惰性等特性[60]。Hou等[61]首先将α-Glu结合到脂质体囊泡中，然后采用反蒸发法将其负载到多孔二氧化硅表面，制备成受体脂质体生物膜色谱柱，用于五味子提取物的α-Glu抑制剂筛选，并通过体外实验进一步证实了五味子苷的降糖作用。2.2 有机载体材料2.2.1 中空纤维 中空纤维是一种具有孔径和内腔的有机聚合物，具有比表面积大、生物材料和有机溶剂消耗低，且设备便宜、用于中空纤维制备的材料来源丰富，是酶、细胞、脂质体等生物材料的理想载体，已被应用于酶固定化中。首先，对中空纤维进行活化。然后，将酶与已活化的中空纤维孵育使酶被吸附在中空纤维上。最后，将待测物与中空纤维固定化酶孵育，筛选待测物中潜在酶抑制剂。Zhao等[62]提出了一种基于吸附中空纤维固定化酪氨酸酶（tyrosinase，TYR）的方法，从葛根提取物中筛选潜在的TYR抑制剂。通过液相色谱-质谱分析，成功地检测出了7种潜在活性化合物，并进一步结合体外实验，发现葛根素、葛根素-6-O-木糖苷、葛根素和阿片苷具有良好的TYR抑制活性。中空纤维因其具有孔径、内腔及比表面积大等优点，为酶提供了充分的附着空间，但由于其清洗较为困难，导致重复利用率低。2.2.2 生物传感器 生物传感器是一种对生物物质敏感并可将其浓度转换为电信号进行检测的仪器。丝网印刷电极因其具有批量生产、低成本、高重现性、小尺寸等特点而被广泛应用于分析领域。所谓酶生物传感器法，是将酶固定在经过修饰的丝网印刷电极上，当与抑制剂接触时会发生电信号变化，通过检测电信号的变化，达到分析检测的目的。Elharrad等[63]为筛选药用植物中潜在的XOD抑制剂，研制了一种简便、灵敏的安培生物传感器，并用于测定多种药用植物对黄嘌呤氧化酶的抑制率，发现留兰香和马齿苋2种植物对黄嘌呤氧化酶抑制活性较高。以普鲁士蓝修饰丝网印刷电极表面，极大降低了生物传感器的检测电位，使该装置具有较高的选择性。该传感器具有结构简单、选择性好、成本低、稳定性好、结果快速等优点。2.2.3 纸 自2007年Whiteside研究小组首次提出微流体装置概念以来，纸作为一种新的载体材料，以其良好的生物相容性、大的比表面积、易于修饰、价格低廉等优点，在环境监测、化学检测、生物医学诊断等领域具有广阔的应用前景[64]。（1）滤纸：三维打印技术是利用一种纸分析仪器将纸张制作成为一种特殊的微流体装置，该装置成本低，具有较高的比表面积，易于结合分子吸附蛋白质。使用过的纸张设备可以很容易地通过燃烧来处理，可减少实验消耗品造成的污染。Guo等[65]将三维打印技术用于酶抑制剂的筛选，首先，用3D印刷的聚己内酯对滤纸进行改性，形成疏水区。然后，对滤纸进行准确切割，得到既具有亲水性又具有疏水性的改性纸。接下来，用壳聚糖对亲水区进行改性。最后，将α-Glu固定在亲水区，制备出具有独特微流体结构的三维打印技术微装置，并成功地将该方法用于筛选植物提取物中具有α-Glu抑制活性的物质，发现绿原酸、槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸、异槲皮素和槲皮素4种化合物对α-Glu的抑制活性较好。该方法结合一些便携式探测器，如手机和照相机，可以获得定性和定量的结果。因此，很容易判断酶在纸上的固定化效果。（2）纤维素滤纸：纤维素滤纸（cellulose filter paper，CFP）具有成本低、来源广、表面积大、生物相容性好、表面羟基含量高等优点，被选为新型酶固定化载体，而且CFP可以快速从酶反应混合物中分离并终止反应，从而缩短了操作时间，简化了其他载体（如纳米材料和磁性纳米颗粒）所需的分离过程。Li等[66]以纤维素滤纸为载体，对α-Glu进行固定化。利用多巴胺的自聚-粘附行为，通过希夫碱反应和迈克尔加成反应，将聚多巴胺复合层包覆α-Glu与改性后的CFP共价结合形成固定化酶（CFP/DOPA/α-Glu）。用CFP/DOPA/α-Glu筛选11种中药中的α-Glu抑制剂，发现诃子对α-Glu的抑制作用最强。Zhao等[67]以CFP为载体，以壳聚糖为物理包覆剂引入氨基基团，然后以戊二醛为交联剂，通过希夫碱反应，将AchE与氨基功能化的CFP共价键合进行固定化酶。最后，将CFP固定化AchE应用于17种中药的抑制剂筛选。2.2.4 金属-有机骨架 金属-有机骨架（metal- organic framework，MOFs）为一种杂化多孔材料，由有机连接体和金属节点通过强的化学键组装而成。MOFs具有可调节孔径、大比表面积和热稳定性等优点。有研究表明，酶被固定在MOFs上后，其在可重用性、催化活性和稳定性方面的性能都有了很大的提高。Chen等[68]首先将ZrCl4和氨基对苯二甲酸溶于N,N-二甲基甲酰胺溶液中进行超声，然后分别加入HCl和HAc，得到混合物。随后，将混合物转移到不锈钢聚四氟乙烯内衬的高压釜中密封加热，反应混合物在空气中冷却至室温，然后离心。沉淀物用新鲜N,N-二甲基甲酰胺和无水乙醇洗净，后减压干燥，合成了金属有机骨架UiO-66-NH2。UiO-66-NH2通过沉淀交联固定化猪胰脂肪酶（porcine pancreatic lipase，PPL），得到的PPL@MOF具有较高的PPL载量和相对活力恢复率，并将PPL@MOF复合物用于筛选夏枯草脂肪酶抑制剂，发现了13种潜在的脂肪酶抑制剂。与磁珠、纳米粒子相比，MOFs材料酶固定量大、相对活力恢复率高。2.2.5 酶微柱 有研究者采用酶微柱法用于酶抑制剂的筛选，该方法属于固相萃取技术，操作简单，可与高效液相色谱耦合，实现了在线筛选，提高了酶抑制剂的筛选和分析效率。首先将硅胶分散在乙醇中，加入3-氨基丙基三乙氧基硅烷形成氨基功能化硅胶，然后将氨基功能化的硅胶与酶液混合，使酶固定在硅胶表面，洗去未结合酶，最后将酶固定化硅胶填入不锈钢微柱中形成酶微柱。Peng等[69]运用该方法成功的从金银花中筛选和鉴定XOD抑制剂。该方法与高效液相色谱的在线耦合提高了筛选和分析效率。与传统的与二维色谱耦合相比，该方法为直接与HPLC耦合，缩短了分析检测时间。3 总结与展望中药含有的化学成分复杂、种类繁多、作用机制比较复杂，一直是获取活性成分或者先导化合物的重要来源。以酶为靶标进行药物筛选是发现和寻找新药的重要环节之一。随着固定化酶技术的发展，研究者将固定化酶技术与中药酶抑制剂的筛选相结合，并通过高效液相色谱-质谱联用技术进行鉴定，筛选得到很多具有酶抑制活性的化合物，在一定程度上明确了中药发挥作用的活性成分及其作用机制。本文以不同载体材料为分类，综述了固定化酶技术在中药酶抑制剂筛选中的应用。磁珠是最常用的磁性载体材料，该类材料利用磁力吸引可使固定化酶配体配合物快速从体系中分离，且固定化方法简单，而且使用后的磁珠可以回收利用，能有效减少人力物力的投入。非磁性载体材料主要以石英毛细管应用最为广泛。此外，还有中空纤维、纳米管、生物传感器等材料用于筛选中药中的酶抑制剂，丰富了固定酶的载体材料。固定化酶技术在酶抑制剂筛选上的应用前景十分广泛，不仅节省了人力物力而且提高了新药研发的效率。目前，固定化酶技术仍然存在一些问题，如酶与载体材料的结合率较低、固定化酶的活力也会有所下降等。但相信随着科学技术的不断发展及酶抑制剂研究的不断深入，固定化酶技术会成为酶抑制剂筛选最有前景的方法之一。利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突