奥法木单抗

p 　　单克隆抗体的生产方式赋予了它们复杂且具有异质性的分子特点。通常需要借助多种正交分析技术才能全面表征各种变体。 在本应用纪要中，我们使用质谱这种强大的工具对阿达木单抗进行了表征。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 简介 /span /strong /p p 　　Humira& reg (阿达木单抗)是一种FDA和EMA批准的抗TNFα抗体，被用于治疗多种炎症性疾病，包括类风 湿性关节炎、幼年特发性关节炎、银屑病关节炎、银屑病和克罗恩病。它是2014年销量最高的单克隆抗体产品，全球销售额超过130亿美元。 /p p 　　阿达木单抗是由CHO细胞表达的完全人重组抗体。 和所有通过重组DNA技术制备的蛋白质一样，其最终产品是不同变体的混合物。我们必须全面表征产品的异质性，因为这会影响其安全性和功效。 /p p 　　质谱是目前被广泛使用的生物药物表征技术之一。得益于硬件和软件的创新，该技术现已得到常规应用。在本应用纪要中，我们将使用质谱对Humira& reg 进行不同水平的表征。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 完整阿达木单抗的表征 /span /strong /p p 　　利用质谱分析单克隆抗体最简单的方式就是测定完整蛋白质的分子量。该检测可提供有关蛋白质鉴定和糖基化谱图的有用信息。 /p p 　　测定时需要对抗体脱盐，去除制剂缓冲液中的非挥发性盐类。脱盐步骤可使用超滤装置离线完成，但该过程非常耗时。配备反相色谱柱的液相色谱是一种替代方法：盐类在死体积内洗脱并被导入废液，然后用乙腈水溶液梯度将单克隆抗体洗脱到质谱仪的离子源中。 /p p 　　典型分析条件如表1所示。应当注意，考虑到传质限制，须采用较高的柱温以改善峰形，进而提高MS灵敏度。 /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 表1：阿达木单抗完整质量数测定的分析条件 /span /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/83d0cd65-f7b9-4177-b0f7-5ff513e8505b.jpg" title=" 1_副本.jpg" / /p p 　　所得电喷雾质谱图为包络迹线，其中包括不同电荷态的蛋白质。使用MaxEnt& reg 算法进行去卷积处理，得到更容易解析的谱图(见图1)。通过去卷积谱图可轻松确定糖基化谱图。 /p p 　　在阿达木单抗上观察到的主要糖型为G0F/G0F和G0F/G1F，质量精度通常低于20 ppm。 /p p 　　如果需要测定不含糖基的蛋白质的分子量，为了简化谱图，可进行去糖基化。通常采用PNGase F酶去糖基化，但反应时间相当长(需要数小时甚至过夜)。为了加快分析速度，我们选用了Rapid PNGase F酶(纽英伦生物技术公司)。在50 ° C下温育10～15 min后， 获得完全去糖基化的抗体。该反应可在大多数制剂缓冲液中直接进行，无需更换缓冲液。对应的质谱图如图2所示。由于质谱图得以简化，我们可轻松观察到其它修饰，例如C端赖氨酸剪裁。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/da262e93-2bdb-4c3b-b5df-dfcf6b1eb709.jpg" title=" 2_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图1：完整阿达木单抗的电喷雾质谱图(A)和MaxEnt& reg 去卷积质谱图(B)。 /span /p p strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " /span /strong /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/175a864c-b84f-4c37-bd2f-de937b179ade.jpg" title=" 3_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 strong 　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " /span /strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图2：N-去糖基化阿达木单抗的电喷雾质谱图(A)和MaxEnt& reg 去卷积质谱图(B)。 /span /p p 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " IdeS酶解后的阿达木单抗亚基分析 /span /strong /p p 　　尽管完整质量数测定(经过或不经过去糖基化处理)已经能够快速简单地鉴定抗体及确定糖基化分布，高分离度对于色谱分离和质谱测定而言通常也很有价值。 /p p 　　完整抗体的大小(约150 kDa)限制了分离度。还原二硫键可得到轻链和重链，但在低丰度变体的测定中，重链(约50 kDa)仍然是一个问题。 /p p 　　IdeS酶(Genovis，商品名FabRICATOR& reg )是采用质谱法表征单克隆抗体时的重要工具。酶解并还原二硫键之后得到的肽段(见图3)分子量约为25 kDa，因此可采用LC/MS分析，而且色谱分离度和质量精度极佳。 此外，样品制备仅需不到一小时。该方法通常被称为 “自中而上”策略。 /p p 　　或者，也可使用IdeS和Rapid PNGase F(后者须在还原条件下反应)进行连续酶解，获得去糖基化的肽段。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/b21e335e-8fd8-445a-a855-c340edabcbd1.jpg" title=" 4_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图3：用IdeS酶解mAb之后还原二硫键 /span /p p 　　为了大限度提高色谱分离度，我们优化了分析条件。 最关键的参数是色谱柱的性质以及流动相中所用的改性剂。 使用不同色谱柱获得的色谱图如图4所示。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/d4c71121-5a2b-4cc0-b26d-53ba57dfce8f.jpg" title=" 5_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图4：使用不同HPLC色谱柱分离经IdeS酶解和二硫键还原所得的阿达木单抗肽段的结果比较 /span /p p 　　由图可观察到明显差异，购自Thermo的MabPac RP色谱柱所得的结果最佳。我们在该色谱柱上测试了两种改性剂： 甲酸(FA)和三氟乙酸(TFA)，以及这两种改性剂的混合物。 /p p 　　最佳分析条件如表2所示。图5展示了用IdeS酶解阿达木单抗之后，还原或不还原二硫键所得的色谱图。测得分子量的质量精度低于1 Da。得益于良好的色谱分离度，我们还可分离并定量各种变体，例如N端焦谷氨 酸、无糖基化变体或氧化物质。 /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 表2：阿达木单抗亚基分析条件 /span /p p style=" text-align: center" br/ /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/6afe117f-4c86-4523-8404-641d94e12497.jpg" title=" 无标题_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图5：经IdeS酶解和DTT还原的阿达木单抗样品的LC/MS分析结果 /span /p p style=" text-align: left " 　　该方法还可用于研究抗体氧化。我们使用不同浓度的H2O2 进行了强制氧化研究。在20 ° C下温育45分钟后， 用IdeS酶解样品，然后用DTT还原，最后通过LC/MS 进行分析。所得液相色谱图如图6所示。 /p p 　　不同峰的质谱鉴定非常简单直接。可明确测得Fc/2和 F(ab’)2 区域的氧化物质浓度增加。 /p p 　　在稳定性研究中，这种分析方法非常适用于监测单克隆抗体的氧化。亚基水平的分析能够粗略定位氧化位点。更精确的定位可通过肽图分析实现。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/e3b20720-c738-41e3-91c0-9912e87e02a5.jpg" title=" 6_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 　图6：色谱图随H2O2 浓度增加发生的变化 /span /p p 　　 strong span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 通过UPLC-UV-MS sup E /sup 肽图分析对阿达木单抗进行鉴定和目标纯度分析 /span /strong /p p 　　肽图分析策略涉及使用特定的蛋白酶(例如胰蛋白酶) 得到小分子肽，再利用LC与UV和/或MS检测联用的方法分析所得的肽混合物。 /p p 　　随着液相色谱和质谱技术不断进步，采用肽图分析法分析单克隆抗体现在已经能够达到接近100%的序列覆盖率，同时详尽表征翻译后修饰。 如今，人们在常规分析中使用亚2 µ m色谱柱获取高分离度肽图，而借助高分辨率质谱则能够以低于 5 ppm的质量精度实现肽的鉴定。 /p p 　　除了质量测定以外，还可使用MSE模式记录碎片数据。 在MSE采集模式下，仪器每秒交替采集低能量和高能量谱图，因此几乎可以同时获得分子质量和序列信息 (图7)。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/fbe321ec-3274-4d6b-acb9-2fe1c51b3e85.jpg" title=" 7_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图7：MSE采集模式的原理。 /span /p p 　　过去MS检测通常仅用于方法开发，但随着功能强大且经过验证的软件被开发出来，质谱法现在也被应用于常规分析中。 /p p 　　放大后的阿达木单抗肽图分析基峰离子(BPI)色谱图如图9所示。这些数据使用表3所列的分析条件获得。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/4fac9c35-d14d-446a-89bb-bbf9abfa6226.jpg" title=" yaji_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 表3：阿达木单抗肽图分析的分析条件 /span /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/d1e374ea-bc16-4db0-a1c8-2da8667c190f.jpg" title=" 8_副本.jpg" / /p p 　　使用UNIFI软件解决方案(沃特世)基于分子量对每个峰进行鉴定(质量数容差5 ppm)，进而计算出序列覆盖率 (图8)。 必要时，可使用碎片数据(MSE)确证胰蛋白酶肽的鉴定结果。图10展示了碎片离子谱图的一个示例(MSE-高 能量)。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/b0cc8c39-7298-4968-af6d-87b4ec76d53a.jpg" title=" 9_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图8：利用UPLC-UV-MSE对阿达木单抗进行肽图分析并采用UNIFI软件解决方案处理数据之后所得的序列覆盖图 /span /p p 　　肽图分析法还可用于评估单克隆抗体的纯度。完整质量数测定和亚基分析能够提供单克隆抗体纯度的大体情况，肽图分析法则能够进行目标纯度分析。可评估的主要修饰包括： /p p 　　■ 脱酰胺化 /p p 　　■ 氧化 /p p 　　■ 糖基化 /p p 　　■ N端焦谷氨酸 /p p 　　■ C端赖氨酸截断 /p p 　　即使UPLC肽图的分离度再高，色谱分离度通常也不足以通过UV检测对修饰进行相对定量。因此，我们使用MS数据进行定量分析。该过程可使用UNIFI等软件解决方案完全自动化地完成。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/daf3b1a7-ab1b-4c9c-ac80-08dea0ac6ed9.jpg" title=" 10_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图9：阿达木单抗的肽图(BPI色谱图) /span /p p 　　使用该方法分析阿达木单抗样品，获得了如下结果： /p p 　　■ 序列覆盖率：100%(质量数容差10 ppm)。 /p p 　　■ 使用更苛刻的标准(质量数容差5 ppm， 至少以2b/y碎片离子确证鉴定结果)所得的序列覆盖率仍然非常高(93%)。 /p p 　　■ 重链上2.9%的N端谷氨酸以焦谷氨酸形式存在。 /p p 　　■ 大部分重链都不含C端赖氨酸(89%)。 /p p 　　■ 在轻链的152N上观察到了显著的脱酰胺化。 /p p 　　■ 观察到的主要糖型为G0F、G1F和G2F，相对强度分别为75%、23%和2%(基于糖肽EEQNSTYR)。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/93a63c98-dd03-4921-a7cf-236379984a3c.jpg" title=" 11_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图10：阿达木单抗轻链T1肽的高能量MSE谱图(带标注) /span /p p 　　利用UPLC与荧光检测和高分辨率质谱检测联用的方法对阿达木单抗进行N-糖分析 /p p 　　大多数治疗性单克隆抗体都是IgG类抗体，在重链的Fc 区氨基酸297N处有一个糖基化位点(见图11)。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/30b15311-c672-40c6-aa50-920177aaee2e.jpg" title=" 12_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图11：单克隆抗体中常见的N-糖 /span /p p 　　糖基化是单克隆抗体的一项关键品质属性，因为Fc区 域的N-糖特征可影响抗体与Fc受体的结合，从而调控 ADCC和ADCP活性。末端半乳糖对于补体依赖性细胞毒性(CDC)也很重要。最后，糖基还会影响治疗性抗体的安全性。 /p p 　　因此，必须采用灵敏且可重现的方法来表征单克隆抗体的糖基化以及批次间一致性。得益于优异的分离度和重现性，使用亚2 µ m色谱柱分析2-AB标记的N-糖成为了表征单克隆抗体的首选方法。不同游离寡糖的相对定量通常采用荧光检测法。 /p p 　　该方法的两个缺点是样品制备时间长(通常为2～3天)， 且很难鉴定低丰度游离寡糖。 /p p 　　我们对方案进行了优化，将样品制备时间缩短为不到一天，并结合高灵敏度MS/MSE和荧光检测建立了自动化MS工作流程。包括数据处理和报告在内的整个流程可在24小时内完成(见图12)。表4汇总了分析条件。 /p p 　　阿达木单抗的UPLC/FLUO色谱图如图13所示。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/448b85af-dfca-4b58-a3af-3513a8a0c928.jpg" title=" 13_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图12：N-糖分析工作流程 /span /p p 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 表4：阿达木单抗游离N-糖的分析条件 /span /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/df32e840-8042-4c12-a9a9-bffa7781485a.jpg" title=" Ntang_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/8bd603a8-3e4d-4b31-8107-a23999844b42.jpg" title=" 15_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图13：阿达木单抗N-糖分析所得的UPLC/FLUO色谱图 /span /p p 　　鉴定不仅基于游离寡糖的分子量，还基于“葡萄糖单元 ”(GU)校准。大多数情况下，将这两种方法相结合都能准确鉴定N-糖。必要时，可使用MSE模式下采集的碎片数据来确证鉴定结果，或者在两个假定结果之间做出选择。GlycoWorkbench应用程序可用于解析碎片谱图。带标注的MSE谱图示例如图14所示。 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/3092e407-ec1b-42c8-b670-c1ca726e5f52.jpg" title=" 16_副本.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 图14：分析阿达木单抗样品中的2-AB标记G0F游离寡糖所得的高能量MSE谱图(带标注) /span /p p 　　检出的主要N-糖(占所有检出N-糖的95%)列于表5中。 /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" color: rgb(0, 112, 192) " 表5：阿达木单抗样品中检出的主要N-糖 /span /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/de10208a-c2b3-41e2-91a2-acf08569e5c8.jpg" title=" 17_副本.jpg" / /p p 　　有趣的是，使用本应用纪要所列的不同方法测得的要糖型比率非常一致(仅考虑所有方法都能检出的糖型，即G0F、G1F和G2F)，如表6所示。 /p p 　　表6：使用不同方法获得的阿达木单抗糖型测定结果比较 /p p style=" text-align: center" img src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201711/insimg/753139b8-e6e8-4a94-9a6e-a0411df6303b.jpg" title=" 18_副本.jpg" / /p p 　　 strong 注：本文引自Quality Assistance的应用文章。 /strong /p p br/ /p

p 　　 span style=" color: rgb(146, 208, 80) " 药物与机体生物大分子结合的部位即药物靶点。当前国际上药物研发领域竞争的焦点之一就是药物靶点的研究和发现。新的药物靶点的发现往往会成为一系列新药发现的突破口，靶点研究对药物研发企业的意义不言而喻。本文对单抗领域TOP10的热门靶点及代表性药品进行盘点与简要分析，如VEGF/VEGFR、TNF-α、CD20、HER2以及白介素家族靶点成员。 /span /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 192, 0) " 药物靶点定义： /span 协和医学院药物筛选中心主任杜冠华对药物靶点这样定义：药物靶点是能够与特定药物特异性结合并产生治疗疾病作用或调节生理功能作用的生物大分子或生物分子结构 对物质的结构产生生物效应，在复杂调节过程或作为通路中具有主导作用 病理条件下对物质的表达、活性、结构或特性可以发生改变。 /p p span style=" font-size: 18px " strong 　　单抗热门靶点TOP10 /strong /span /p p 　　我们从国内外上市及国内临床三个维度统计了近7年与靶点相关联的药物数/临床试验数总和，得出了关联总数前10的靶点。 /p p style=" text-align: center " img width=" 599" height=" 300" title=" A.jpg" style=" width: 443px height: 237px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/24aa8bee-9dc0-4490-b61b-db727c57c173.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 　图：关联国内上市单抗药物数TOP10靶点 /span /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px " img width=" 599" height=" 305" title=" D.jpg" style=" width: 425px height: 262px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/5479a955-b9de-4c7f-8526-154f8c74b67d.jpg" / /span /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" font-size: 14px " 图：关联国外上市单抗药物数TOP10靶点 /span /p p style=" text-align: center " span style=" font-size: 14px " img width=" 599" height=" 298" title=" E.jpg" style=" width: 397px height: 263px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/a31ee332-fbe0-4aeb-9c92-e8ae4654cc00.jpg" / /span /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" font-size: 14px " 图：关联国内临床试验数TOP10靶点 /span /p p 　　 span style=" font-size: 18px " strong 国内上市单抗药品作用靶点榜首：VEGF/VEGFR /strong /span /p p 　　国内上市单抗药品作用的靶点，排名第一的是VEGF/VEGFR，对应上市药品数量达到8个，其中国产药品1个，进口药品7个 strong 。 /strong /p p strong 　 /strong strong span style=" color: rgb(255, 192, 0) " 　 /span span style=" color: rgb(255, 192, 0) " (一)VEGF/VEGFR靶点主要作用机制：血管生成信号通路 /span /strong /p p 　　血管内皮生长因子(Vascular Endothelial GrowthFactor，VEGF)，是细胞内刺激血管生成的信号蛋白，具备促进血管新生和再生的功能。VEGF通过与细胞膜表面的血管内皮生长因子受体(VEGFR，又称酪氨酸激酶受体)结合，通过一系列信号通路传导产生生物学效应最终导致血管生成。VEGF家族主要包括5种：VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE。 /p p 　　1971年Folkman首次提出了肿瘤性血管生成理论，肿瘤的生长依赖于肿瘤的血管生成。VEGF(VEGFR)靶点抗体通过特异性结合VEGF(VEGFR)，从而抑制下游信号通路，实现抑制血管生成的目的。 /p p 　　 strong span style=" color: rgb(255, 192, 0) " (二)VEGF/VEGFR靶点代表药品 /span /strong /p p 　　贝伐珠单抗(Bevacizumab)是第一个针对VEGF靶点的人源化的单克隆抗体，具备高亲和力且特异性地结合 VEGF，达到抑制肿瘤血管增生的作用。2004年基因泰克公司的贝伐珠单抗(商品名安维汀Avastin)获得FDA批准上市，用于转移性结肠癌治疗。 /p p 　　除了实体瘤、湿性黄斑变性(AMD)发病机制中有异常血管生成，针对VEGF血管生成信号通路的靶向药物对该病有明确的治疗效果。上市公司康弘药业(002773.sz)当家品种，康柏西普(商品名朗沐)是我国自主研发的新一代抗VEGF融合蛋白，也是中国首个获得世界卫生组织国际通用名的生物1类新药。 /p p 　　FDA已经批准的针对VEGF/VEGFR单抗或融合蛋白有贝伐珠单抗、雷珠单抗、阿柏西普、雷莫芦单抗。雷珠单抗是一种抗VEGF单克隆抗体片段，是由基因泰克公司开发于2006年首次通过FDA批准上市，商品名诺适得(Lucentis)，用于是视网膜黄斑变性治疗。诺适得是基因泰克旗下首个VEGF单抗安维汀的Fab片段，与安维汀的作用机理一致。 /p p 　　除了单抗药物，作用于VEGFR的小分子药物对其他酪氨酸激酶也有抑制作用，已经上市的有索拉非尼，舒尼替尼等多个品种。上市公司恒瑞医药(600276.sh)明星产品阿帕替尼，作为民族制药企业自主研发的第一个国家1.1类抗癌新药，也是恒瑞第一个拥有自主知识产权的小分子靶向药物，其作用的靶点就是VEGFR。阿帕替尼也是全球第一个治疗胃癌的小分子靶向药物。阿帕替尼能够高度选择性的与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)结合，阻断信号传导，强效抗肿瘤血管生成，从而抑制肿瘤的生长、转移和散播。 /p p 　　 span style=" font-size: 18px " strong 国产单抗药品作用靶点榜首：TNF-α /strong /span /p p 　　TNF-α是国产单抗药物最成熟的靶点，在已上市的10个国产单抗药物中，有3个单抗药靶点是TNF-α。 同时，TNF-α也是全球目前销售额排行首位的药品阿达木单抗作用的靶点。在2017年全球药品销售额前十榜单中，有四款药物靶点是TNF-α，其中三款是单抗药物。 /p p 　 span style=" color: rgb(255, 192, 0) " strong 　(一) TNF-α靶点主要作用机制：免疫细胞调节 /strong /span /p p 　　肿瘤坏死因子-α(Tumor Necrosis Factor-α,TNF-α)是一种主要由单核/巨噬细胞分泌的细胞因子(细胞信号蛋白)，在系统性炎症的发生发展中有重要作用。 /p p 　　TNF有两种类型—TNF-α和TNF-fl，两者有相似的生物学特性，其中TNF-fl主要由T细胞产生，目前对其功能研究不多。 TNF-α由157个氨基酸残基组成，其许多生物学活性都是通过细胞膜上受体介导的。 /p p 　　TNF-α主要功能是调节免疫细胞，作为一种内源性致热源，可以导致发热、引起细胞凋亡，阻止肿瘤发生和抑制病毒复制等。TNF-α功能失调与多种疾病相关联：比如阿尔茨海默症、银屑病、癌症、重度抑郁、肠炎等。 /p p 　 span style=" color: rgb(255, 192, 0) " strong 　(二) TNF-α靶点代表药品 /strong /span /p p 　　以TNF-α为靶点的3个国产单抗药物中，最早上市的是中信国健(现改名三生国健)的益赛普，获批时间是2005年，主要用于类风湿性关节炎治疗。最近获批的以TNF-α为靶点国产药物是上市公司海正药业的安佰诺，是一种TNF-融合蛋白单抗产品，同样用于类风湿性关节炎治疗。 /p p style=" text-align: center " img width=" 599" height=" 107" title=" F.png" style=" width: 548px height: 93px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/a332158e-09a2-414d-b1a7-c5a3c4b8c18e.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 　表：以TNF-α为靶点的国产单抗药物 /span /p p 　　在TNF-α靶点药物中就有连续6年霸占全球药品销售额排行榜榜首的阿达木单抗(商品名修美乐Humira)。修美乐是由总部位于美国芝加哥的艾伯维公司(AbbVie)于2002年获得FDA的批准上市。生产厂商艾伯维公司财报显示修美乐 2017年全球销售额达到惊人的184亿美元，较上年增长26.9亿美元，增速仍高达17%。修美乐是全人源化单抗药品，也是全球第一个上市的全人源化单抗药物。 /p p 　　2017年全球药品销售额前十榜单中，除了排名首位的阿达木单抗靶点是TNF-α，排名第二的来那度胺、排名第四的依那西普单抗以及排名第五的英夫利昔单抗的靶点也是TNF-α。其中来那度胺是小分子靶向药。 /p p 　　英夫利昔单抗(商品名类克)是由强生、默克和三菱田边公司联合开发的全球第一个TNF-α抑制剂，1998年获批FDA批准上市。类克是一种人鼠嵌合单抗，用于类风湿性关节炎、强制性脊柱炎、银屑病等自身免疫性疾病的治疗。2017年类克全球销售额达到77.6亿美元。依那西普是辉瑞和安进公司联合开发，适应症是类风湿性关节炎、强制性脊柱炎，2017年全球销售额78.9亿美元。 /p p 　　 span style=" font-size: 18px " strong CD20：B细胞主要生命周期表达的膜蛋白，淋巴瘤治疗重要靶点 /strong /span /p p 　　CD20为大家所熟悉很多都是通过罗氏的明星产品美罗华。美罗华自从问世以来，其与小分子化疗药物的联用已经成为某些特定类型的非霍奇金淋巴瘤的标准治疗方案。美罗华在商业上的巨大成功也让CD20成为药企最热门的药物开发靶点之一。CD20靶点单抗全球销售规模超过70亿美元，是商业价值较大的药物开发靶点之一。 /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 192, 0) " strong (一) CD20：主要参与B细胞的增值与分化 /strong /span /p p 　　CD20(Cluster of Differentiation 20)是位于B淋巴细胞表面的一种跨膜磷蛋白。B淋巴细胞是由骨髓内多能干细胞分化而成，是负责体液免疫的功能细胞，其发育经过祖B细胞(Pro-B)，前B细胞(Pre-B)，不成熟B细胞(Immature B)以及成熟B细胞(Mature B) 几个阶段。CD20在造血干细胞、祖B细胞以及成熟的浆细胞上并不表达，主要出现在前B细胞到成熟B细胞阶段。 /p p 　　非霍奇金淋巴瘤B细胞来源的比例占比达到70%，抗CD20的抗体可直接抑制B细胞 生长并诱导其凋亡。CD20在人体细胞中的表达方式、生物学作用和存在形式决定了其成为治疗B淋巴细胞瘤的主要靶点。虽然CD20的功能尚不完全清楚，但有证据表明抗CD20单抗杀伤B细胞来源肿瘤的作用机制主要有三种：抗体依赖的细胞毒作用，补体依赖的细胞毒作用，以及抗体与CD20分子结合引起的抑制细胞生长， 改变细胞周期以及凋亡等直接效应。 /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 192, 0) " strong (二)CD20靶点代表药品 /strong /span /p p 　　以CD20为靶点的单抗药物可以分为三代，第一代利妥昔单抗(商品名美罗华)、替伊莫单抗(商品名泽娃灵)，第二代奥法木单抗(商品名Arzerra)以及第三代阿妥珠单抗。利妥昔开创了靶向治疗B细胞淋巴瘤的先河，属于人鼠嵌合单抗 第二代的奥法木单抗是人源化单抗，第三代单抗Fc段被修饰。 /p p 　　在研数据显示，目前有十几个厂商正在开展针对CD20靶点的单抗研发，单抗研发领域实力较强的几家悉数参与：包括复星集团旗下的复宏汉霖、沃森生物参股的嘉和生物以及向港交所递交上市申请的信达生物、上市公司海正药业、华兰生物等。 /p p 　　美罗华1997年获得FDA的批准在美国上市，是全球第一个被批准用于非霍奇金淋巴瘤的单抗药物，2000年在国内获批上市。美罗华2017年全球销售额59.7亿美元，位居全球药品销售榜单第8位。在利妥昔单抗类似物的研发竞争中，三生国建的进度最快，已经完成临床研究，正在申报上市。 /p p style=" text-align: center " img width=" 594" height=" 336" title=" A.png" style=" width: 431px height: 247px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/15f3397f-7610-4177-abf9-1410313e0fd1.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　 span style=" font-size: 14px " 　图 美罗华全球销售额(单位：亿美元) /span /p p 　　奥法木单抗(商品名Arzerra)是第一个全人源化单抗，2009年通过FDA的批准上市。Arzerra 2016年全球销售额5700万美元。受依鲁替尼的竞争，Arzerra 2016年的销售额相比2015年下滑19%。除了奥法木，第二代CD20单抗药物还包括罗氏开发的人源化单抗奥瑞珠。奥瑞珠是首个在多发性硬化领域获得突破性疗法的产品。第三代抗CD20单抗的Fc段经过了糖基化修饰，通过修饰可以提高抗体的特异性以及与抗原结合的亲和力。第三代抗CD20单抗阿妥珠单抗由罗氏研发成功并于2013年获得FDA批准上市。 /p p 　　 span style=" font-size: 18px " strong HER2：乳腺癌药物经典靶点，预后重要指标 /strong /span /p p 　　HER2是迄今为止乳腺癌研究较为透彻的基因之一，HER2基因的过度表达不仅与肿瘤的发生发展关系密切，也是临床预后的重要指标。 /p p 　 span style=" color: rgb(255, 192, 0) " strong 　(一)HER2:生物学作用通过启动信号通路导致细胞增殖 /strong /span /p p 　　HER2(人表皮生长因子受体 2)是具有酪氨酸激酶活性的表皮生长因子受体家族的一个成员。受体的聚合作用会导致受体酪氨酸残基的磷酸化，并启动多种信号通路导致细胞增殖和肿瘤发生。大约15%~30%乳腺癌和10%~30%的胃癌会发生HER2基因扩增或过度表达。 /p p 　 strong span style=" color: rgb(255, 192, 0) " 　(二)HER2靶点代表药品 /span /strong /p p 　　目前国内上市的以HER2为靶点的单抗药物只有1个，就是知名度极高的罗氏生产的赫赛汀，化学名曲妥珠单抗。以HER2为靶点的国内上市药品中还有一个小分子药物，是葛兰素史克公司生产的泰立沙，化学名拉帕替尼，2013年通过CFDA审批上市。泰立沙2007年获得FDA的批准在美国上市。 /p p style=" text-align: center " img width=" 599" height=" 145" title=" B.png" style=" width: 528px height: 115px " src=" http://img1.17img.cn/17img/images/201808/insimg/ece5967d-c7a6-470a-851c-f75a104bd7cb.jpg" / /p p style=" text-align: center " 　　 span style=" font-size: 14px " 表：在FDA获批的HER2靶点药物 /span /p p 　　赫赛汀是最早上市的HER2靶向药物，主要适应症是HER2阳性乳腺癌。赫赛汀1998年获FDA批准在美国上市，2000年在欧洲上市，2001年在日本上市，2002年中国上市。2017年赫赛汀全球销售额71.44亿美元，位居全球药品销售排行榜第5位。 /p p 　　 span style=" font-size: 18px " strong 白介素/白介素受体家族靶点成员 /strong /span /p p 　　白介素是由多种细胞产生并作用于多种细胞的一类细胞因子，白介素是目前发现种类最多，调控作用最广泛的一类细胞因子。第一个白介素分子(IL-1)1977年被发现，此后陆续发现了40多种白介素分子。以白介素家族成员为靶点的药物包括融合蛋白、抗体等多种形式。国内上市单抗白介素靶点主要是IL2R和IL-6R。 /p p 　　 span style=" color: rgb(255, 192, 0) " strong (一)IL2R与IL6R生物学作用：免疫调节重要功能因子 /strong /span /p p 　　IL2R(interleukin-2 receptor)是一种三聚体蛋白，在淋巴细胞等免疫细胞膜表面表达，通过与IL2结合发挥生物学作用。IL2R通过三种形式与IL2结合：通过α链、β链或γ链。这三种IL2R链都是跨膜并延伸到细胞膜内，具有向胞内传递生化信号的作用(α链不参与信号传导)。IL2和IL2R对于免疫系统有重要的调节功能，通过直接作用于T细胞在免疫耐受和维持正常免疫功能方面发挥功能。IL6是一种多功能细胞因子，可以调节细胞生长、分化，并参与免疫应答的生化过程。IL6及其受体的失调与多种疾病的发生有关，比如多发性骨髓瘤、自身免疫性疾病、前列腺癌等。 /p p 　 span style=" color: rgb(255, 192, 0) " strong 　(二)IL2R与IL6R靶点代表药品 /strong /span /p p 　　IL2R靶点国内上市的药品只有1个，诺华公司生产的巴利昔单抗，商品名舒莱，用于预防肾移植术后器官排斥反应。巴利昔单抗通过与IL2R的α链特异性结合阻断了IL2与IL2R的结合。IL2R在激活的T淋巴细胞表面表达。IL2通过与IL2R结合，介导了T淋巴细胞的活化并引发一系列的病理过程，这一过程恰恰是移植手术后细胞免疫导致的排异反应的关键机制。巴利昔单抗1998年获得FDA批准上市。 /p p 　　IL6R靶点国内上市的药品也只有1个，罗氏公司生产的托珠单抗，商品名雅美罗，用于类风湿性关节炎的治疗。雅美罗最早于2005年在日本上市，2010年通过FDA审批在美上市，2013年获得进口注册引入国内。 /p p /p

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