氮杂吲唑

利用eXtended Performance（XP）色谱柱改进美国药典（USP）噻康唑有机杂质分析方法Kenneth D.Berthelette、Mia Summers和Kenneth J.Fountain沃特世公司，美国马萨诸塞州米尔福德方案优势■ 使用XP色谱柱改进耗时的USP美国药典有机杂质分析方法，实现更快速的分析并减少溶剂的使用量，同时仍符合美国药典621章指南的规定。■ 将样品运行时间缩短80%，从而提高了生产能力。■ 将溶剂用量减少90%，降低了运行成本。沃特世提供的解决方案ACQUITY UPLC H-Class系统Alliance HPLC系统XSelect&trade CSH&trade C18色谱柱Empower 3软件eXtended Performance [XP] 2.5 &mu m色谱柱 TruView&trade LCMS认证最大回收样品瓶关键词美国药典方法、噻康唑、ACQUITY UPLC色谱柱计算器、沃特世反相色谱柱选择表、仿制药引言全世界的制药企业在日常工作中都需要对仿制药中的有机杂质进行分析。使用较为陈旧的仪器和色谱柱技术进行有机杂质分析，因为需要长时间使用大量的溶剂，所以既耗时又费钱。然而通过使用显著改进的仪器和色谱柱技术有机杂质分析会变得更高效。2.5&mu m 粒径的eXtended Performance（XP）色谱柱设计用于高效液相色谱和超高效液相色谱。该色谱柱是改进美国药典方法的理想选择，因为其能够使色谱分析工作者实现更小粒径和低扩散系统带来的利益，同时能够符合美国药典621章色谱分析指南的规定。621章列出了允许的方法变化幅度。噻康唑是一种用于治疗酵母菌感染的咪唑类抗真菌化合物。被转换的方法是噻康唑有机杂质的分析方法2。有机杂质分析方法用于测定样品中是否存在杂质及其含量。该XP色谱柱方法是从最初在HPLC系统上的色谱柱规模的美国药典方法缩放至HPLC和UPLC仪器上的。在HPLC仪器上使用XP色谱柱对现行美国药典方法进行改进能够缩短运行时间，从而提高了常规分析实验室的样品通量。而在UPLC系统上使用XP色谱柱则可以比HPLC进一步缩短运行时间并减少溶剂的使用，从而节约了总成本。实验条件Alliance 2695 HPLC色谱条件流动相： 44:40:28乙腈/甲醇/水加2 mL氢氧化铵分离模式： 等度洗脱检测波长： 219 nm色谱柱（L1）： XSelect CSH C18，4.6 x 250 mm，5 &mu m，部件号：186005291；XSelect CSH C18 XP，4.6 x 150 mm，2.5 &mu m，部件号：186006729；XSelect CSH C18 XP，4.6 x 100 mm，2.5 &mu m，部件号：186006111柱温： 25 ℃洗针液： 95:5乙腈/水样品清洗液： 95:5水/乙腈密封垫冲洗液： 50:50甲醇/水流速： 根据方法调整进样量： 根据方法调整ACQUITY UPLC H-Class色谱条件流动相： 44:40:28 乙腈/甲醇/水加2 mL氢氧化铵分离模式： 等度洗脱检测波长： 219 nm色谱柱（L1）： XSelect CSH C18 XP，4.6 x 150 mm，2.5 &mu m，部件号：186006729；XSelect CSH C18 XP，4.6 x 100 mm，2.5 &mu m，部件号：186006111；XSelect CSH C18 XP，2.1 x 150 mm，2.5 &mu m，部件号：186006727柱温： 25℃洗针液： 95:5乙腈/水样品清洗液： 95:5水/乙腈密封垫冲洗液： 50:50甲醇/水流速： 根据方法调整进样量： 根据方法调整数据管理： Empower 3软件样品描述用100%的甲醇将噻康唑样品制备成表1所述的浓度。将样品转移至一个进样用的TruView最大回收样品瓶中（部件号：186005662CV）。结果与讨论全世界制药企业都需要对常规方法制备的噻康唑进行日常分析。本应用纪要使用美国药典专论中规定的有机杂质分析方法，在几种不同规格的色谱柱上对噻康唑及其有关物质A、B、C的分离进行了比较。因为噻康唑许多杂质缺乏实际可用性，所以将噻康唑有关物质A、B、C用作低浓度杂质标准品。美国药典所列的有机杂质分析方法用于分析复杂的样品处方。样品中多种成分的有效分离通常需要使用更长的色谱柱。使用较大填料粒径（&ge 3.5 &mu m）的长色谱柱会使运行时间加长，溶剂使用量增大。例如，最初的美国药典中的噻康唑有机杂质分析需要使用4.6 x 250 mm，5 &mu m的色谱柱，分离时间长达30分钟，每分析一个样品需要耗费30 mL溶剂。但是，使用2.5&mu m粒径的eXtended Performance（XP）色谱柱，可以在缩短运行时间的同时仍然符合考核的要求。由于运行时间缩短，样品通量得到了提高，每次分析所需溶剂减少，从而降低了总成本。现行的美国药典621章色谱分析指南规定了允许的方法变化幅度。这些允许的变化包括± 70%的色谱柱长度变化，-50%的粒径变化，± 50%的流速变化。1美国药典要求有关物质B和C之间的分离度要达到1.5，本应用纪要证明:在不同的色谱柱和不同的色谱系统之间进行的方法转换完全满足对这两个难分离化合物的苛刻要求。在HPLC仪器上使用XP色谱柱进行有机杂质分析噻康唑的有机杂质分析方法需要使用L1专用色谱柱，为该分离而列出的色谱柱是LiChrosorb RP-182。参照沃特世反相液相色谱柱选择表，本文选用更先进的XSelect CSH C18固定相色谱柱。之所以选择XSelect CSH C18色谱柱是由于其与所列出的色谱柱相类似，并且能提供适用于HPLC UPLC仪器的各种规格和粒径。本文首先使用一根XSelect CSH C18，4.6x250mm，5&mu m色谱柱在Alliance HPLC系统上运行美国药典方法，流速1.0mL/min。如表2所示，本次分离符合考核标准。本次分离的总运行时间为30分钟，在连续批量分析样品时，将面临着时间和成本管理的双重挑战。如果使用原始的美国药典方法， 8小时的一个工作日仅能分析16个样品，要消耗480mL溶剂。通过使用XP色谱柱，在同样的8小时工作日内可分析80个样品，且仅需使用240mL溶剂，显著地提高了样品通量并降低了运行成本。在不同的系统上使用2.5&mu m XP色谱柱改进的标准方法具有通用性，同时仍符合美国药典621章指南的要求，如图1所示。XP色谱柱是一款2.5-&mu m颗粒的HPLC和UPLC色谱柱，经高效填装并能够承受UHPLC系统的高压，使XP色谱柱在HPLC和UPLC仪器上均能使用。本纪要的标准方法首先从最初的4.6 x 250 mm，5 &mu m色谱柱转换至4.6 x 150 mm，2.5 &mu mXP色谱柱，用以说明使用更小粒径的色谱柱可以缩短运行时间。使用更小的粒径还可以提高分离能力，用色谱柱长度与粒径的比值（L/dp）即可预测。在本例中，L/dp从50,000（初始条件）提高到60,000（4.6 x 150 mm XP色谱柱）。根据ACQUITY UPLC色谱柱计算器的计算，用于该XP色谱柱的最佳流速为2.0 mL/min3。但是，这个流速超出了美国药典621章指南规定的变化范围。故采用1.0 mL/min的流速以保证符合美国药典指南的规定，同时也适应HPLC系统反压的限制。噻康唑及其有关物质在原始色谱柱上与在4.6 x 150 mm XP色谱柱上的分离进行了对比，如图2A-B所示。4.6 x 150 mm XP色谱柱将运行时间缩短43%，分离度提高5%，如图2所示。接着使用一根更短的4.6 x 100 mm，2.5 &mu m XP色谱柱进行分离，用以说明在实现更快速分离的同时，仍保持着合格的分离度。运行时间的缩短对于有机杂质分析尤其有用归因于附加的分离复杂性，这些方法一般比其他方法具有较长的运行时间。需要注意的一个重要问题是，不一定任何时候都会选用具有较低分离能力（L/dp 40,000）的较短色谱柱。例如在辅料和杂质洗脱时间很接近的情况下可能需要保持原始的分离能力。图2C显示了使用4.6 x 100 mm，2.5&mu m XP色谱柱进行分离时，与初始条件相比，运行时间缩短57%，并且仍然符合所有的考核标准，如图2所示。在这种情况下，L/dp从50,000（初始条件）降低至40,000导致有关物质B与C之间的分离度降低15%；但分离度仍然符合要求，这取决于原始分离的复杂程度。在UPLC仪器上使用XP色谱柱进行有机杂质分析如图1所示，通过同时使用XP色谱柱和ACQUITY UPLC色谱柱计算器，该方法可以从Alliance HPLC系统转换至ACQUITY UPLC H-Class系统上。更新的仪器，例如ACQUITY UPLC H-Class系统，可以实现更快速、更高效的分离，归因于其高反压耐受能力、进样之间更快速的平衡以及显著降低的系统体积和扩散。为了对比HPLC和UPLC系统之间的分离能力，将图2B中所示的使用4.6 x 150 mm，2.5 &mu m颗粒的 XP色谱柱进行的有机杂质分析方法在ACQUITY UPLC H-Class系统上重新运行，如图3A所示。仅仪器本身的变化&mdash &mdash 从HPLC变到UPLC，会使B与C色谱峰之间的分离度增加5%，使运行时间缩短12%，如表2和表3所示。分离度的增大归因于UPLC系统的低系统体积和低扩散，因为这两个属性都可以改善峰形。为进一步说明UPLC仪器的优点，如图3B所示在UPLC系统上使用4.6 x 100 mm XP色谱柱进行分离。此分离操作使B与C色谱峰之间的分离度从使用HPLC系统时的1.6（参见表2）提高到使用UPLC系统时的1.8（参见表3）。在UPLC系统上使用4.6 x 100 mm XP色谱柱，得到与在HPLC系统上用原始方法分离相同的分离度，但是比原始方法快57%。最后，将标准方法转换至一根2.1 x 150 mm 2.5 &mu m XP色谱柱上。这根色谱柱的测试结果说明通过减小色谱柱的内径，在保留相同分离度的同时，还能进一步缩短运行时间，并且大大减少溶剂用量。根据ACQUITY UPLC色谱柱计算器的计算，适合这根色谱柱的流速为0.42 mL/min。但这个流速超出了美国药典621章指南的要求，因此实验使用符合规定的0.5 mL/min流速。分析得到的色谱图（如图3C所示）显示，如表3所示与原始条件相比运行时间缩短80%，而适用性要求仍很容易达到。此外，仅仅通过减小色谱柱的内径分析就比使用4.6 x 150 mm XP色谱柱快63%，如图3A所示。最后，通过使用2.1 x 150 mm XP色谱柱，与原始的标准方法相比，溶剂用量减少90%，显著地节约了成本。当对流速进行调整，以保持在美国药典621章指南规定的范围内时，B和C色谱峰的分离度从1.9下降至1.8，但仍符合考核标准。结论在进行既耗时又费钱的有机杂质分析时，在现有HPLC系统上使用eXtended Performance [XP] 2.5 &mu m色谱柱，与原始的美国药典方法相比，可以缩短运行时间和减少溶剂用量57%。通过将XP色谱柱与UPLC仪器相结合，运行时间可减少80%，溶剂用量可减少90%。既能在HPLC仪器上运行又能在UPLC仪器上运行的XP色谱柱的实用性可以用于在遵循现行美国药典621章指南的同时，改进美国药典方法。在常规分析实验室中，使用经更小粒径色谱柱改进的美国药典方法，可以节约大量的时间和运行成本。参考文献1. USP General Chapter 621, USP35-NF30, 258. The United States Pharmacopeial Convention, official from August 1, 2012.2. USP Monograph. Tioconazole, USP35-NF30, 4875. The United States Pharmacopeial Convention, official from August 1, 2012.3. Jones MD, Alden P, Fountain KJ, Aubin A. Implementation of Methods Translation between Liquid Chromatography Instrumentation. Waters Application Note 720003721en. 2010 Sept.

岛津中国创新中心与北京阳光诺和药物研究股份有限公司和中国食品药品检验研究院合作，采用岛津二维高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法（2D-LC-QTOF），对头孢美唑钠热降解的未知杂质进行了定性鉴定。 背景介绍β-内酰胺类抗生素，主要包括头孢菌素类、青霉素类和碳青霉烯类。头孢美唑是第二代半合成的头孢类抗生素。2020版《中国药典》，美国药典（USP43）和日本药典（JP17）都收录了注射用头孢美唑钠。在注射用头孢美唑钠的质量研究中，发现其对热比较敏感，头孢美唑内酯（cefmetazole lactone）和1-甲基-5-巯基四氮唑（1-methyl-5-mercaptotetrazolium）在高温条件下均有明显增加，主峰后出现3个明显的未知杂质。 某仿制药和参比制剂样品中实际检出的未知杂质含量超过了ICH Q3B规定的鉴定阈值（头孢美唑日用最大剂量为4g，对应的杂质鉴定阈值为0.10%；部分样品中如图1所示杂质3的量超过0.10%），故尝试对注射用头孢美唑钠检出的未知杂质进行结构分析。图1给出了注射用头孢美唑钠热解样品的一维（图1A）和3种目标杂质（杂质1-3）的二维（图1B）紫外色谱图。图1 注射用头孢美唑钠热解样品的一维(1A)和3种目标杂质（杂质1-3）的二维(1B)色谱图 解决方案岛津液相系统Nexera LC-40 +高分辨质谱仪LCMS-9030 基于二维液相色谱-高分辨质谱系统，采用中心切割技术将在一维中采用含非挥发性盐的流动相中分离得到的目标未知物导入二维色谱，在二维色谱中采用质谱兼容的挥发性流动相，进而采用高分辨质谱对未知物进行定性鉴定。一维色谱采用《中国药典》中注射用头孢美唑钠的有关物质检查方法，流动相中含不挥发的磷酸盐和离子对试剂（四丁基氢氧化铵，TBAH）。二维色谱采用C18色谱柱，利用磷酸盐在色谱柱上不保留，TBAH在高比例水相下不易洗脱等性质，通过阀切换技术和改变流动向比例等方法洗脱导入废液，避免质谱污染。 表1 头孢美唑钠中杂质的分子式、加和离子和误差 在结构解析中，通过比较头孢美唑钠和未知降解杂质的母离子及特征碎片离子的相关性，结合文献报道的头孢类抗生素及杂质的裂解规律，对头孢美唑钠中的三种未知杂质进行科学合理的定性分析。表1列出了三种未知杂质的分子结构和误差。以杂质2为例，在正模式下的一级质谱图（见图2A）：主要离子为m/z 488.0320，m/z 372.0160，m/z 505.0586。m/z 488.0320与m/z 505.0586相差17，可推断m/z 505.0586为m/z 488.0320的[M+NH4]+峰。m/z 488.0320的二级产物离子质谱图（见图2B）。推测杂质2的结构和裂解规律（见图3），杂质2可能为7-甲巯基头孢美唑。同时，7-甲巯基头孢美唑也是一种常见的头孢美唑杂质。 图2 杂质2在正模式下的扫描离子(2A)和m/z 488.0320的产物离子质谱图(2B) 图3 杂质2可能的结构和质谱裂解规律 结论本研究对头孢美唑中的3种未知杂质进行了科学合理的定性分析，对于头孢美唑的质量控制及安全性评价具有重要意义。本分析方法适用于β-内酰胺类抗生素中未知杂质的分离和定性，具有很强的通用性，同时可对化学药物、天然产物、多组分生化药等复杂组成体系进行定性鉴别，从而提供可靠的质量控制分析方法。 本工作基于创新中心搭建的专属性中心切割二维反相色质谱联用分析平台（2D-LC-QTOF）和开发的《抗生素杂质数字化标准品数据库》，该数据库收录了β-内酰胺类抗生素的一般杂质和聚合物杂质的色谱和高分辨质谱数据，还登录了抗生素相关杂质的液相色谱-三重四极杆质谱分析方法。该分析平台不仅为企业客户大大降低了企业研发成本，同时也为企业的工艺改进、剂型研发、品质提升等方面提供技术参考。 参考文献：《采用二维高效色谱-串联四级杆飞行时间质谱法对注射用头孢美唑钠的未知杂质进行结构解析》《中国药学杂志》中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1001-2494(2022) 08-0645-06 doi: 10.11669/cpj.2022.08.009

沃特世ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA系统和ACQUITY UPLC/Xevo TQ MS系统分析饮料中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑含量赵嘉胤.蔡麒.孙庆龙引言焦糖色素是一种允许使用的着色剂，我国对焦糖色使用量的规定除个别产品外均为按生产需要适量使用，其中规定仅有亚硫酸铵法生产地焦糖色允许使用在碳酸饮料中。而以加氨或其铵盐制成的焦糖（Ⅲ类氨法焦糖和Ⅳ类亚硫酸铵法焦糖）会产生4-甲基咪唑，并且4-甲基咪唑是一种能够诱发肿瘤的高水平的化学物质。焦糖色素被广泛用于食品以及饮料中，所以4-甲基咪唑的含量监控也是必须被重视的，由于4-甲基咪唑分子极性很大，含量很低，所以如何快速、准确地检测出其含量，就成为人们现阶段研究的重点。目前我国国家标准中只有《焦糖色中的4-甲基咪唑的测定-高效液相色谱法》，而对于饮料中的4-甲基咪唑则没有相关检测方法。沃特世（Waters）公司所提供的整体解决方案，同时来监控饮料中的4-甲基咪唑以及2-甲基咪唑。使用沃特世SPE的固相萃取策略来对于复杂的样品基质进行净化，完成对于4-甲基咪唑以及2-甲基咪唑的提取浓缩，而沃特世HILIC模式的色谱保留，对于极性分子的色谱分离提供完美的效果，最后通过UPLC H-CLASS PDA以及UPLC/Xevo TQ MS的分析，完成出色的定性定量工作。 实验条件样品前处理方案固相萃取SPE解决方案&mdash &mdash Oasis MCX (3cc/60mg) 小柱净化取3g饮料样品，超声5分钟,后待净化。ACQUITY UPLC H-CLASS PDA超高效液相色谱分离条件：色谱柱： ACQUITY UPLC BEH HILIC Column 2.1x100 mm,1.7&mu m流动相 A： 乙腈流动相 B： 5mM甲酸铵柱温： 35˚ C检测波长： 215nm进样量： 5&mu L运行时间： 3min梯度表： Time (min) Flow (mL/min) %A Curve 0.00 0.5 80 6 3.00 0.5 80 6ACQUITY UPLC Xevo TQ MS超高效液相色谱-串联质谱分析条件：色谱柱： ACQUITY UPLC BEH HILIC Column 2.1x100 mm,1.7&mu m流动相 A： 乙腈流动相 B： 5mM 甲酸铵柱温： 35˚ C进样量： 2&mu L运行时间： 3min梯度表： Time (min) Flow (mL/min) %A Curve 0.00 0.5 80 6 3.00 0.5 80 6实验结果及讨论1、ACQUITY UPLC H-CLASS PDA分析混合标准品色谱图饮料空白样品图基质添加回收色谱图2、ACQUITY UPLC/Xevo TQ MS分析混合标准品TIC3.2.3 茶饮料样品加标与空白对比分析3.2.4 可乐样品加标与空白对比分析 通过分析结果可以看出，4-甲基咪唑和2-甲基咪唑分子极性很大，一般反相很难保留，多用离子对试剂来增加保留，但由于离子对色谱方式平衡时间很长，增加整体分析周期，同时对于色谱柱以及仪器的损耗很大，最关键是无法进行有效的质谱方法分析。而沃特世公司HILIC模式的极性分析方案可以非常好的进行极性分子的保留，流动相简单，优异兼容质谱条件，使4-甲基咪唑和2-甲基咪唑有非常好的分离效果以及灵敏度。同时由于目标化合物极性很大，对于前处理的要求非常高，分离提取是个难点，而沃特世公司的固相萃取方案能使样品达到非常好的净化效果，通过Oasis MCX进行保留分离，同时能够减少样品杂质对于色谱柱以及整个仪器系统的损害。由沃特世ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA和ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS所提供的超高效性能以及灵敏度，使得4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的分析达到理想效果。结论1.采用ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA和ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS可以快速高效地对4-甲基咪唑和2-甲基咪唑的含量进行测定，ACQUITY UPLC H-CLASS-PDA灵敏度可以达到1mg/kg，ACQUITY UPLC / Xevo TQ MS灵敏度可以达到1&mu g/kg。2.应用沃特世固相萃取SPE解决方案配合HILIC模式色谱保留，对于大极性的小分子有很好的保留以及分离提取的作用，达到理想净化效果以及色谱分离效果。3.从样品前处理到样品色谱质谱分析的整体解决方案，给客户提供一体化的服务解决样品分析过程中可能遇到的所有问题，帮助客户成功！ 关于沃特世公司 (www.waters.com)50多年来，沃特世公司(NYSE:WAT)通过提供实用和可持续的创新，使医疗服务、环境管理、食品安全和全球水质监测领域有了显著进步，从而为实验室相关机构创造了业务优势。作为一系列分离科学、实验室信息管理、质谱分析和热分析技术的开创者，沃特世技术的重大突破和实验室解决方案为客户的成功创造了持久的平台。2011年沃特世公司拥有18.5亿美元的收入，它将继续带领全世界的客户探索科学并取得卓越成就。联系方式：叶晓晨沃特世科技（上海）有限公司 市场服务部xiao_chen_ye@waters.com周瑞琳(GraceChow)泰信策略(PMC)020-8356928813602845427grace.chow@pmc.com.cn