甘胂米特

40多年来，对不稳定样品采用冻干剂型一直是制药界的共识。然而，这带来了一些挑战，得到完美且坚固的冻干饼外观就是其中之一——这决定了样品是否可以承受冷冻干燥后的运输和保存等过程。目前主要对冻干蛋糕进行定性分析以确定蛋糕外观是否稳定，但这样的分析得到的结果比较主观，无法提供进一步分析所需要的数据。 图1：定性分析结果合格的冻干饼（左为甘露醇，右为葡聚糖）如图1所示，葡聚糖和甘露醇这两种截然不同的赋形剂可用作冻干制剂中的填充剂或热稳定剂。冷冻干燥后，葡聚糖和甘露醇都会产生白色的饼状物，并且看起来结构相似，很可能在生产后通过质量控制的目视检查。然而，含有这些赋形剂的冻干蛋糕可能具有非常不同的物理特性，这可能会影响蛋糕在运输后的外观，以及它们的复原速度。因此需要一小批来提供关于冷冻干燥产品在运输过程中保持稳定的概率的定量数据。1、MicroPressMicroPress提供关键数据 图2：MicroPress冻干饼强度定量分析仪MicroPress是一种可以原位定量测定冻干饼强度和物理特性的仪器。通过设置参数和分析方法，MicroPress将能够分析您的冻干饼结构。这允许对您的产品进行快速有效的批量筛选，节省大量时间和人员成本。使用MicroPress可以在不到一分钟的时间内完成冻干饼的定量分析。MicroPress能够提供关键数据，说明所生产的产品是否能够在从制造现场到临床现场甚至到当地药房的潜在破坏性过程中幸存下来。虽然 MicroPress 分析会在冻干饼表面留下一个小凹痕，但仍可用于其他类型的分析如Karl-Fischer和DSC，以提供更多信息。2、如何使用MicroPress分析冻干饼？如表1所示，根据浓度对样品溶液进行区分，并稀释到100ml水中。容器为6ml玻璃小瓶，每个小瓶填充2ml：样品浓度配方编号甘露醇10mg/ml120mg/ml230mg/ml3葡聚糖10mg/ml420mg/ml530mg/ml6 表1：配方详情列表这些小瓶采用如表2中所示的方法进行冷冻干燥。所有样品均使用相同的一组参数进行分析，使所有样品充分预冻并尽可能增大结晶的尺寸，然后再进行初级干燥步骤。在初级干燥阶段，降低压力以促进冰的升华，从而更快地干燥产品。所有样品都放在冻干机的同一托盘上，以控制干燥过程中出现的变量。预冻程序StepTemp(℃)Time(min)Vacuum(mTorr)Ramp/Hold1205OffH2-40120OffR3-40120OffH干燥程序StepTemp(℃)Time(min)Vacuum(mTorr)Ramp/Hold1-4600100H20801006302700100H4204050R52072050H 表2：冻干程序详情列表所有样品均使用MicroPress上的相同参数设置进行分析（见表3）。MicroPress采用人性化的软件设计，参数设置简单，随时可根据需要进行更改。阶段速度（mm/s）压头延伸10定位0.1*次挤压0.05第二次挤压4停止- 表3：MicroPress运行程序延伸阶段以10mm/s的速度将压头移动到预估冻干饼高度的5mm以内；定位阶段找到蛋糕的顶部；一旦检测到顶部，就会开始挤压冻干饼，然后记录施加在冻干饼上的力。从图3（左）可以看出，3%葡聚糖显示出弹性特性，这个特性由减压阶段从40%应变返回到18%应变的曲线得到证明。图3（右）描绘了3%甘露醇冻干饼的*结果，它显示了与3%葡聚糖非常不同的图表。右图显示了一个易碎的饼体，它无法承受太大的压力。 图3：3%葡聚糖（左）与3%甘露醇（右）在MicroPress中的分析图像甘露醇的浓度从1%增加到2%的过程中，杨氏模量（Youngs Modulus）从最弱到最强增加了近10倍（图4左）。但从3%甘露醇的强度并不比2%高 ,相反3%甘露醇冻干饼的平均杨氏模量降低了，但相比2%浓度的标准偏差有所增加，样本之间的差异变得更大。图4右显示提升葡聚糖浓度的结果是得到了比甘露醇强得多的冻干饼，且葡聚糖的浓度从1%到3%，冻干饼的杨氏模量增加了107%，发生变形所需的力倍增。由于蛋糕的整体强度超过了MicroPress 的测量范围，无法确定其能承受的*应力。然而，这可以通过更小直径的压头来解决，以确保能达到被测量冻干样品的*应力。 图4：不同浓度的甘露醇（左）和葡聚糖（右）得到的平均杨氏模量结果从以上结果可以看出，MicroPress能够确定蛋糕的杨氏模量和冻干饼在结构破坏前所能承受的*应力。上述的结果表面，对于塑造更好的冻干饼外观，甘露醇的性能不及葡聚糖。杨氏模量和*应力也与冻干配方中赋形剂的浓度相关——浓度越高，冻干饼越结实。甘露醇相对缺乏稳定性和强度可能与许多因素有关，比如冻干饼的孔径和多态性。 图5. 由MicroPress记录并分析的各个样品的强度数据结论MicroPress清楚地定量分析了冻干样品的强度和物理特性。它的分析过程可以得到更精确的冻干饼强度数据，因此更确定冻干样品在整个运输和处理过程中保持外观和性能稳定。这些结果证实甘露醇使用甘露醇作为赋形剂来增加蛋糕强度可能并不是一个理想的选项。

干体炉产品概述Pegsus新型干体炉提供了较宽的温度范围，它具有独立的三通道温度指示器，可以校准多支测试探头。在干体炉内部具有自动温度循环系统，所校准的温度及校准数据可以记录和储存。这种技术的应用，极大的提高干体炉的稳定性、准确度，使设备表现出最佳的使用性能。此外，在干体块的上边具有50mm的绝缘层，有效的避免了设备在工作过程中对操作者可能产生的危险。 干体炉产品特点 ★性能卓越，响应速度快，温度范围宽★可校准高温热电偶★直径为33.5mm*深130mm的校准容积★适用于现场校准和实验室校准★可用于热电阻、热电偶、4～20mA过程信号、开关量信号的测量干体炉产品参数 Pegasus1200新型多功能一体炉性能曲线 注：红线——干体炉及所配对传感器的审核校准性能曲线蓝线——径向均匀性不同型号之间的对比 创新点：新型干体炉提供了较宽的温度范围，它具有独立的三通道温度指示器，可以校准多支测试探头。在干体炉内部具有自动温度循环系统，所校准的温度及校准数据可以记录和储存。这种技术的应用，极大的提高干体炉的稳定性、准确度，使设备表现出最佳的使用性能。此外，在干体块的上边具有50mm的绝缘层，有效的避免了设备在工作过程中对操作者可能产生的危险。ISOTECH爱松特 干体炉 P1200

今年的诺贝尔生理与医学奖颁给了剑桥大学的 John B Gurdon (79岁)和日本京都大学的 Shinya Yamanaka(山中伸弥，50岁) 。Gurdon得奖是因为他50多年前在牛津大学的工作，他是第一个利用成熟体细胞转入到胚胎细胞中并成功克隆出生物个体的，并且发明的细胞核转移技术一直被广泛应用(如克隆羊多莉)。 而山中伸弥得奖是因为成功的将成熟的体细胞诱导成具有分化能力的多功能干细胞(IPS, Induced pluripotent stem cells),而这项工作是在2006年完成的。大多数重大成果都要等上十几年到几十年(如 Gurdon 等了50年)才能拿到诺贝尔生理与医学奖，而山中的工作只等了6年，可知其重要意义。　　山中伸弥另外一个抢眼的原因是 他之前并不是做干细胞研究的，之前做的是脂肪代谢，转到干细胞研究也是十多年前，并且是由于脂肪代谢研究失败才阴差阳错才转行的。而他的诺贝尔奖之路也是从他现在任职的单位之一，美国加州大学旧金山分校的Gladstone 研究所开始的。　　1993年，31岁的山中伸弥在日本大阪城市大学医学博士毕业之后，放弃了做整容医生赚大钱的机会转而做基础研究，他想在美国找一个做博士后的工作，不过尽管投了不少简历但等了很久也没有收到回信，后来才等到了 旧金山Gladstone 研究所 T om Innerarity 的回信，答应给他一个博士后的位置，T om Innerarity 是 Gladsone 研究所的资深研究员，研究工作主要是跟心血管相关。 Gladstone 研究所成立于1979年， 整个研究所最初研究方向是心血管疾病和病毒引起的疾病上，后来又多了个神经退行性疾病的方向。当时研究热门是引起心脏病的罪魁祸首- -低密度脂蛋白(或称坏胆固醇)，研究所之前的研究发现了坏胆固醇的主要成分是一种叫做apoB的蛋白，这种蛋白在人体内有两种不同结构，长结构和短结构，长结构一般存在于肝脏中，并且参与了坏胆固醇的累积，而短结构一般存在于肠中，并且是相对无毒性的。 山中在 Tom Innerarity 实验室中的课题就是寻找一种新的降低坏胆固醇的方法，在这之前他得弄明白 apoB蛋白的这两种结构是怎么形成的，只要找到了形成的机制，就可以控制长结构的形成进而阻止坏胆固醇的累积。在最初的实验中，山中鉴定了一种叫做APOBEC-1的酶，在肠中这种酶可以缩短aopB的结构使其毒性变小。而在肝脏中，这种酶是失活的。在老板T om Innerarity 指导下，山中与其他实验室成员开始寻找在肝脏中激活APOBEC-1的方法，只要APOBEC-1 激活就可以减少长结构的apoB进而减少坏胆固醇的形成。　　经过一连串实验之后，他们终于发现老鼠肝脏中坏胆固醇降低了，不过实验却有另外一个意想不到的结果 —- 老鼠得了肝癌。这对整个实验小组是个打击，本以为减低了坏胆固醇降低心脏病的发生却产生了另外一个更加严重的副作用。当实验室其他人都对实验结果很沮丧时，山中却产生了好奇心，他想弄明白到底是什么原因导致了老鼠得了肝癌。 他想是不是因为开启了APOBEC-1的在肝脏的表达才导致了肝癌呢?进一步的实验完善了他的想法, APOBEC-1 的开启改变了一个叫做NAT1蛋白，这个蛋白在被修饰后就会导致癌症的产生。山中觉得他自己找到了产生癌症的关键，那就是失去功能的NAT1。下一步，山中要研究NAT1缺失的老鼠，想看看他们是否也会得癌症。为了这个目的，他需要做基因敲除的老鼠，这其中就需要到胚胎干细胞。胚胎干细胞是万能的，他们可以分化成各种各样的细胞如皮肤细胞，肌肉细胞和血细胞。他首先是求助于他在研究所的朋友 Robert Farese，后者把他介绍给了 研究所当时做胚胎干细胞的专家 Heather Myers。山中要Heather帮他做NAT1敲除的老鼠，并且他要跟她学怎么去做。 Heather后来说很多人都会过来要帮忙做转基因的老鼠，不过只有山中要求亲自参与其中，他想学习操作的每一步，每一个细节，他一直说是因为以后还要做基因敲除的老鼠，他说他现在学会了，以后就不会麻烦她了。　　不过NAT1敲除的老鼠一直都没做出来，这让他和Heather感到很沮丧，不知什么原因，他们发现NAT1缺失之后，胚胎干细胞就不能继续发育成熟，它们只是不断的复制但不会分化为其他细胞。不过这也正好表明NAT1在胚胎干细胞分化过程中起着很重要的作用，这是他们意外的发现。山中后来在多处场合感激Heather 的帮助，不仅是因为她教给了他做胚胎干细胞的方法，更是因为Heather 告诉他胚胎干细胞不仅可以是个工具，更可以作为研究的重点。　　也就是从这里开始，山中开始了胚胎干细胞的研究之路，与其他实验室研究胚胎干细胞的思路不同，他并不是研究胚胎干细胞怎么分化成其他细胞，他的思路是反着的，他要研究已经分化成熟的细胞怎么变成具有多功能的干细胞，并且这种被诱导成的干细胞跟胚胎干细胞具有相似的功能。经过一系列的摸索，2004年的时候，他实验室就已经确定了24种基因可能参与了成熟细胞转变为干细胞的过程，经过2年的筛选，最终确定了其中最重要的4种基因(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)，并称为山中因子。2006年，他们通过在老鼠的皮肤成纤维细胞中注入山中因子成功将其转变为多功能干细胞，2007年，他们也通过了同样的办法把人的皮肤细胞转变为多功能干细胞，这种干细胞可以与人的胚胎干细胞相比拟。 当他们在2006年第一次把老鼠成熟细胞变成干细胞时，他们自己也不敢相信会这么简单，仅仅4个基因的导入就能起到作用，原本以为会复杂的多，加上那时正是韩国克隆专家黄禹锡造假的时候，所以他们自己也很担心，所以在2006年发表的那篇《CELL》上，尽可能的把实验每个细节都列出来了。再过一年，其他实验室用了他们的技术之后也都相继作出了相关的干细胞，证实了IPS技术是成功的。　　这就是山中伸弥的诺贝尔之路，原本研究胆固醇的博士后，走了一条岔路，歪打正着，写入史册。看了这些，觉得做科研，好奇心很重要，好奇能害死猫，好奇让你能拿奖!