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一、实验目的与原理质粒多为一些双链、环状的DNA分子,是独立于细菌染色体之外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒是进行分子生物学实验操作,进行遗传工程改良物种等工作时最主要的DNA载体。提取质粒的基本步骤分为三步:①细菌的培养和质粒的扩增②细菌菌体的裂解③质粒DNA的纯化本实验采取的菌体裂解方法为碱解法,质粒纯化方法为梯度离心法。二、材料与试剂1、材料:大肠杆菌2、仪器:超净工作台,培养箱,摇床,恒温水浴锅,台式离心机,取液器一套,低温冰箱,冷冻真空干燥机,电泳仪,水平电泳槽,紫外观测仪3、试剂:Solution I 25 mM Tris-Hcl(pH7.4) 10 mM EDTA(pH8.0) 50 mM葡萄糖 高压灭菌,4℃保存 Solution II 0.2 M NaOH, 1%SDS 现配现用 Solution III 5 N KAc pH4.8 高压灭菌,4℃保存 3 M NaAc PH5.2, 高压灭菌,4℃保存。异丙醇,溶菌酶(8 mg/ml),酚/氯仿,无水乙醇,70%乙醇,LB培养基,电泳试剂三、操作步骤1、细菌繁殖LB培养基,2 ml/20ml,37℃,200rpm,摇一摇,过夜2、离心10 min,5000 rpm, 4℃;弃上淸液3、沉淀(菌体细胞)预冷的TES缓冲液洗涤,离心10 min,5000 rpm, 4℃加入预冷的1 ml Solution I,冰浴,10 min4、重新悬浮,加入150 ul溶菌酶母液,室温放置5 min5、加入1.2 ml Solution II, 冰浴,5 min6、加入0.9 ml预冷乙酸钾,混匀,离心10 min,12000 rpm, 4℃7、加入1.5 ml异丙醇,-20℃冰箱内放置15 min8、离心10 min,12000 rpm, 4℃9、取沉淀,悬于400 ul TE缓冲液中10、加入40 ul,3 M NaAc11、酚/氯仿,抽提,乙醇沉淀12、离心10 min,12000 rpm, 4℃13、取沉淀,冷冻干燥,再悬浮于50 ul TE缓冲液中。14、电泳检测提取DNA的质量四、结果与分析超螺旋结构DNA
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[font=宋体][font=宋体]质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的质量和纯度对于生命科学实验至关重要。本文将系统地介绍确定质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]质量[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯度的最佳方法,包括实验室检测与生物信息学分析,旨在为研究人员提供专业、准确和可靠的评估手段。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]1. [/font][font=宋体]引言[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]在生物科学研究中扮演着关键角色,涉及基因表达、基因治疗、基因组编辑等多个领域。因此,确保质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的质量和纯度对于实验的成功至关重要。随着技术的不断发展,确定质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]质量[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯度的方法也在不断改进和完善。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]2. [/font][font=宋体]质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]质量的评估[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]评估质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]质量的方法主要包括电泳分析、酶切鉴定和生物信息学比对。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]2.1 [/font][font=宋体]电泳分析:琼脂糖凝胶电泳是最常用的方法。通过观察电泳图谱,可以判断[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]是否完整,是否存在降解现象。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2.2 [/font][font=宋体]酶切鉴定:使用限制性内切酶对质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]进行酶切,再通过电泳分离酶切产物。如果酶切产物的大小与预期一致,说明质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的结构是正确的。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]2.3 [/font][font=宋体]生物信息学比对:利用基因组学和序列分析工具,对质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的序列进行比对,检测是否存在突变、插入或缺失等变异。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]3. [/font][font=宋体]质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]纯度的评估[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]评估质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]纯度的方法主要包括紫外分光光度计测定、高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法和生物信息学分析。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=Calibri]3.1 [/font][font=宋体]紫外分光光度计测定:在[/font][font=Calibri]260[/font][font=宋体]纳米处测定吸光度值,可以计算出[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的浓度。同时观察[/font][font=Calibri]A260/A280[/font][font=宋体]比值,纯度良好的质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]在该波长下的吸光度值应该较高,且[/font][font=Calibri]A260/A280[/font][font=宋体]比值应接近[/font][font=Calibri]1.8[/font][font=宋体]。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3.2 [/font][font=宋体]高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法([/font][font=Calibri]HPLC[/font][font=宋体]):可以分离和测定质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的组成和浓度,具有较高的灵敏度和特异性,能够检测到低浓度的杂质。[/font][/font][font=宋体][font=Calibri]3.3 [/font][font=宋体]生物信息学分析:利用软件工具对质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]的序列进行分析,预测可能的杂质成分,如蛋白质、[/font][font=Calibri]RNA[/font][font=宋体]等。[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=Calibri]4. [/font][font=宋体]结论[/font][/font][/b][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]确定质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]质量[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯度的最佳方法需要综合运用多种手段。实验室检测方法如电泳分析、紫外分光光度计测定和高效[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p][color=#3333ff]液相色谱[/color][/url]法提供了快速、直观的结果。而生物信息学分析则从序列和组分的角度提供了深入的洞察,使研究人员能够更全面地了解质粒的属性和潜在问题。结合这两类方法,研究人员可以获得关于质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]质量[/font][font=Calibri]/[/font][font=宋体]纯度的准确、可靠的信息,从而确保实验结果的准确性。[/font][/font][font=宋体] [/font][font=宋体][font=宋体]义翘神州提供快速、高通量、高品质以及个性化的[url=https://cn.sinobiological.com/services/plasmid-dna-preparation-service][b]质粒[/b][/url][/font][font=Calibri][url=https://cn.sinobiological.com/services/plasmid-dna-preparation-service][b]DNA[/b][/url][/font][font=宋体][url=https://cn.sinobiological.com/services/plasmid-dna-preparation-service][b]制备服务[/b][/url]。不仅满足实验室研究人员的小量质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]制备需求,也可为生物工业用户和医药公司等提供大规模的质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]制备服务。义翘神州升级改造后的质粒[/font][font=Calibri]DNA[/font][font=宋体]制备平台,采用[/font][font=Calibri]GMP[/font][font=宋体]级别的生产线,对过程和最终产品的严格管控,确保了最终产品质量符合客户需求。义翘神州可以提供从μ[/font][font=Calibri]g[/font][font=宋体]级别,[/font][font=Calibri]mg[/font][font=宋体]级别至[/font][font=Calibri]g[/font][font=宋体]级别不同规模的科研级和工业级别的质粒生产服务,满足不同的需求。详情关注:[/font][font=Calibri]https://cn.sinobiological.com/services/plasmid-dna-preparation-service[/font][/font][font=宋体] [/font][b][font=宋体][font=宋体]义翘神州:蛋白与抗体的专业引领者,欢迎通过百度搜索[/font][font=宋体]“义翘神州”与我们取得联系。[/font][/font][/b]