异丁酰

溴化乙锭——美丽而危险 溴化乙锭（Ethidium bromide，EtBr）是一种经典的荧光染料，在分子生物学研究中有着广泛应用。其化学结构为三苯并咪唑，能够通过嵌入DNA或RNA 的碱基对之间进行非共价结合，从而显著增强荧光信号。这种染料最初作为兽医用药被发现，因其具有强效的诱变性和便捷的核酸染色能力，现已广泛应用于核酸检测、电泳分析及多种生物医学实验中。 一、 化学特性与结合机制 溴化乙锭是一种小分子染料，能够嵌入双链DNA和RNA的碱基对之间，显著增强其荧光强度。与双链 RNA 结合时，荧光强度可增强21倍；与双链DNA 结合时，荧光强度可增强25倍。虽然溴化乙锭在结合单链和三链DNA时亲和力较低，但其结合特性仍足以抑制DNA聚合酶的活性。这些特性使其成为研究 DNA复制、修复及转录的重要工具。 二、 溴化乙锭在科研中的应用 核酸检测 溴化乙锭在分子生物学实验中广泛用于核酸检测，特别是在琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳中。通过在凝胶中加入溴化乙锭，研究人员可以在紫外光下观察到清晰的DNA或RNA条带，从而确定核酸的存在和大小。这种方法简便且高效，是实验室常规操作之一。 荧光定量分析 溴化乙锭的荧光特性使其在荧光定量分析中得到了广泛应用。例如，在定量 PCR和定量RT-PCR中，溴化乙锭通过测量荧光强度来定量分析DNA或RNA。溴化乙锭的高荧光增强效应显著提高了这些分析方法的灵敏度和准确性，广泛用于基因表达研究、病毒载量检测等领域。 细胞膜完整性评估 在细胞生物学研究中，溴化乙锭常用于评估细胞膜的完整性。由于溴化乙锭不能穿透完整的细胞膜，因此只有在细胞膜受损时才能进入细胞并与核酸结合发出荧光。这一特性使溴化乙锭成为检测细胞死亡和细胞膜损伤的有力工具，可用于药物筛选和细胞毒性评估。 线粒体 DNA 研究 溴化乙锭在线粒体DNA研究中也发挥着重要作用。线粒体DNA是研究细胞代谢、遗传疾病和衰老过程的重要对象。溴化乙锭能够有效地分离和分析线粒体DNA，为深入研究其功能提供了工具。例如，在研究线粒体DNA复制和突变时，溴化乙锭可用于追踪和定量分析线粒体DNA。 基因组编辑和转基因研究 在基因组编辑和转基因研究中，溴化乙锭也起到了重要作用。在使用 CRISPR-Cas9等基因编辑技术时，研究人员需要精确检测和定量目标基因的编辑效果。溴化乙锭染色结合荧光显微镜观察，可以帮助研究人员评估编辑效率和识别成功编辑的细胞。此外，在转基因生物的筛选过程中，溴化乙锭可用于检测转基因的插入和表达情况。 三、 光谱特性 溴化乙锭具有独特的光谱特性，其紫外/可见光吸收峰位于多个波长处，包括210 nm、285 nm、316 nm 和343 nm。当溶解在不同溶剂中时，这些吸收峰会发生变化。例如，在水中溶解时，吸收峰位于480 nm，而在甲醇中溶解时则位于520 nm。当与核酸结合时，溴化乙锭的吸收峰会发生红移（向更长波长移动）。 荧光特性 溴化乙锭的荧光特性在不同溶剂和环境中有所不同。在水溶液中，溴化乙锭的激发波长为526 nm，发射波长为605 nm。在磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，其激发波长为360 nm，发射波长为590 nm。此外，在10 mM TBE 缓冲液（pH 8.0）中，其激发波长为525 nm，发射波长为600 nm。随着溶剂极性的降低，溴化乙锭的荧光产量增加，使其在各种生物实验中具有广泛应用。 四、 储存和处理 溴化乙锭应在避光、干燥的条件下储存，以确保其稳定性。在室温下储存时，溴化乙锭粉末可保持稳定至少两年。处理溴化乙锭时应采取适当的安全措施，因为它是一种已知的诱变剂和潜在的致癌物。废弃的溶液和材料应按照规定的生物危害废弃物处理程序进行处理。 五、 配制溶液 在室温下，溴化乙锭在水中以10 mg/mL 的浓度溶解，形成红色溶液。它在水中最多可溶解到20 mg/mL，在乙醇中可溶解到2 mg/mL。水或PBS中的储备溶液在避光条件下至少可稳定两年。 六、 电泳染色步骤 在电泳实验中，溴化乙锭通常以0.5mg/mL 的浓度添加到凝胶和电泳缓冲液中。电泳后，可以将凝胶浸入含有溴化乙锭的缓冲液或水中染色30-45分钟。在某些情况下，可以通过将染色后的凝胶浸泡在水或1 mM MgSO4中进行脱色，以减少背景荧光，从而提高DNA的检测灵敏度。 七、 安全注意事项 由于溴化乙锭具有诱变和致癌风险，处理时应佩戴防护手套和护目镜，并在通风良好的地方进行操作。所有含有溴化乙锭的废弃物应按生物危害废弃物处理，确保对环境和人体的安全。 溴化乙锭作为一种重要的分子生物学研究工具，其独特的荧光特性和广泛的应用领域使其在核酸检测和分析中发挥着关键作用。通过对其特性的深入了解和正确的使用方法，可以更好地应用溴化乙锭进行科学研究。

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导 读 很多爱美人士由于不良的生活习惯——长期熬夜又喜欢吃辛辣刺激性的食物，导致皮肤油脂分泌过旺，出现粉刺甚至痤疮；针对这一情况，市面上很多祛痘型护肤品，对祛除痘印修缮疤痕等有很好疗效。但这类产品中很可能就会含有药用成分的西咪替丁。 西咪替丁是可选择性H2受体阻滞药，临床上用于消化性溃疡的治疗，外用软膏仅见于治疗面部单纯性疱疹。目前外用西咪替丁软膏绝大多数为医药制剂。至今为止，国家药监局未批准过西咪替丁的外用制剂。而且西咪替丁也不在现行版《已使用化妆品原料名称目录》中，因此西咪替丁成分在化妆品中属于非法添加物。2019年8月，国家药品监督管理局发布了《化妆品中西咪替丁的检测方法（高效液相色谱法）》方案，意在禁止西咪替丁成分在非药物制剂产品（化妆品）中的添加和使用，此方案经化妆品标准专家委员会全体会议审议通过并发布。 那么该如何检测有着药用功效的护肤品中是否含有国家禁用的西咪替丁成分呢？ 根据国家药监局发布的2019年第48号通告规定：高效液相色谱法（LC）为定量方法，三重四极杆液质联用法（LCMSMS）为确认方法。采用LCMSMS确认就是要减少杂峰干扰，避免“假阳性”产品的误判。 岛津方案 01 LC测定护肤品中西咪替丁成分的含量岛津公司采用Nexera LC-40液相色谱系统参照《化妆品中西咪替丁检测方法（2019年第48号）通告》，开发了液相色谱检测护肤品中西咪替丁含量的方法。该方法的西咪替丁物质检出限（LOD）为0.011 μg/mL（0.033 ng），定量限（LOQ）为0.036 μg/mL（0.108 ng）；低于标准规定检出限8 ng和定量限24 ng的要求。 仪器条件色 谱 柱：Shim-pack XR-ODSⅡ（100 mm × 2.0 mm I.D.，2.2 μm）流 动 相：A：0.05 mol/L磷酸二氢钾溶液（pH =7.0）；B：乙腈检测波长：215 nm 图1 岛津Nexera LC-40高效液相色谱仪 图2 西咪替丁标准溶液（25 μg/mL）的色谱图（LC） 使用Nexera LC-40液相色谱仪以及SIL-40CXR自动进样器的在线稀释功能分别配制出0.5、5、10、25、50 μg/mL的系列标准溶液。 图3 自动进样器SIL-40CXR稀释功能程序设定（左图）和西咪替丁的标准曲线（右图） 自动进样器预处理程序中的稀释功能可实现样品及标准品溶液的在线稀释，自动化程度及准确度都很高。 实际样品分析准确称取样品0.5 g于25mL比色管中，加入20 mL甲醇，经涡旋混匀，超声提取20 min，静置后取上清液，过滤后上机。 图4 待测样品色谱图(LC) 02 LC测定护LCMSMS定性分析护肤品中西咪替丁（阳性样品判定）参考标准建立LCMSMS法，对阳性样品进行确证。利用LCMSMS的高选择性对样品进行分析，充分提高物质定性的准确率，有效防止误判情况的发生。 仪器条件色 谱 柱：Shim-pack XR-ODSⅡ（100 mm × 2.0 mm I.D.，2.2 μm）流 动 相：A：0.1%甲酸 + 0.002 mol/L乙酸铵水溶液， B：乙腈质谱参数：LCMS-8045，ESI(+) ；多反应监测（MRM） 图5 岛津LCMS-8045三重四极杆液质联用仪 图6 西咪替丁标准溶液（10 ng/mL）的色谱图(LCMSMS) 阳性样品的判定：对上述检出的阳性样品，LCMSMS法需对结果进一步确证。判定依据是：检出组分的色谱峰保留时间一致，待测样品中所选择监测离子相对丰度比与相当浓度标准溶液的选择监测离子相对丰度比的偏差在标准规定范围之内（±20%），则可以判定样品中存在西咪替丁组分。 图7 阳性样品色谱图、质谱图以及定性依据表 03小结针对护肤品中是否含有非法添加物西咪替丁成分，岛津公司开发的液相色谱和液质联用两套分析方案，准确高效地解决了化妆品中禁用添加物的定性和定量问题，这两套解决方案一定会助您一臂之力！ 识别二维码下载应用报告