荧光二向色镜

荧光染料是细胞生物学等科学研究中不可或缺的重要工具，荧光滤色块是荧光显微镜中至关重要的一个部件，只有对两者进行合理的选择和搭配才能拍出理想的荧光图片。在实验室中，荧光染料染色效果不好，荧光滤色块观察效果不佳的情况时有耳闻，如何从琳琅满目的荧光染料和滤色块中挑出适合自己使用的呢？本文首先简单介绍下荧光的相关基础知识，然后通过实例来详细讲解在选择与搭配两者时应该遵从的原则以及需要注意的事项。 首先讲讲我自己的学习历程吧。我是从研究生阶段才开始接触荧光显微镜的，以前在本科的时候也就是用透射光看看各种细菌真菌，然后画个图交上去就完事了。荧光的成像原理要比透射光复杂得多，所以一开始接触荧光这些东西确实挺头大的。由于是老板招的第一届研究生，研究方向是植物细胞生物学，没有师兄师姐带，老板也没时间给我指导这些基础知识，什么都得靠自己学，我的学习之路就是从老板给我的一张Molecular Probes（MP）光盘开始的（图1）。这是一张MP公司的荧光染料操作指南，是老板从美国带回来的，版本是2001年的第八版，里面介绍了各种染料的分子结构，物化属性，染色原理，染液配制，染色步骤，参考文献等等，把各种染料的方方面面都介绍得非常详细。众所周知，MP（2003年被Invitrogen收购）是全球最专业的荧光染料生产商，产品种类齐全，各种新型的荧光染料也层出不穷。我最初的荧光知识就是从这张光盘中学来的，平时在配制和使用染料之前也会仔细阅读里面的操作指南（现在的最新版本是2010年9月份推出的第十一版，大家可以通过Invitrogen网站对相关内容进行浏览）。后来，随着接触荧光显微镜的时间和相关文献阅读的积累，逐渐对这些东西有了更全面更清晰的认识。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/12/201012081704_265538_1856701_3.jpg图1. Molecular Probes公司2001年第八版的荧光探针操作手册一、荧光基础知识的学习 这里给初学者推荐一个学习荧光基础知识的好去处：Invitrogen荧光使用指南http://zh.invitrogen.com/site/cn/zh/home/support/Tutorials.html。网站分Introduction，Spectra和Light Filter and Sources三部分对荧光基础知识进行了详细介绍，教程采用的是Flash格式，图文音并茂，虽然讲解用的是英文，不过配上动画还是很好理解的，如果听不明白的话，可以点击右下角的“NOTES”查看字幕（图2）。相比于传统教材和文献中的文字图片介绍，MP做的Flash教程更适合初学者，直观，易懂。掌握好这三个教程，就算是入门了吧。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/12/201012081704_265540_1856701_3.jpg图2. Invitrogen相关教程中的荧光产生的原理图二、荧光染料的选择与配制 细胞生物学发展到今天，单一荧光染色早已不能满足很多科研实验的需求了，在很多实验中经常需要同时进行双色，三色和多色荧光标记。MP公司的荧光染料已经覆盖了细胞内的各个细胞器和结构，而且每种细胞器或结构都有多种不同颜色的荧光染料以供选择和搭配（图3）。通过图中各种染料，细胞的每个角落都被点亮了，一个普通的细胞瞬间变成了一个色彩斑斓的世界，太神奇了！http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/12/201012081705_265542_1856701_3.jpg图3. 被点亮的细胞：用于标记不同细胞器和亚细胞结构的荧光探针当使用多种荧光染料对各种细胞器和结构进行同时标记时，它们的选择搭配是有讲究的。这里给大家介绍一个很好玩的小工具：Cell Staining Simulation Tool（细胞染色仿真工具）。这是Invitrogen公司最近推出的一个实用小工具，链接http://zh.invitrogen.com/site/cn/zh/home/support/Research-Tools/Cell-Staining-Tool.html。从工具界面的左下角点击需要进行标记的细胞结构，然后选择想染的颜色，再从后面的产品栏中选择一个适合自己样品的染料（有些是染活细胞的，有些是染固定细胞的），选中的染料会出现在右上角，接着进行第二、三、四种细胞结构的标记，注意不同结构尽量选择不同颜色带中的染料进行标记，最后左上角会出现一个仿真的染色效果图。有了这个小工具，自己俨然成了个专画细胞肖像的大画家，赶紧先过把手瘾！我分两次用8种染料给这位细胞画了两幅肖像，第一幅是用DAPI，MitoTracker Red CMRos，Alexa 488 phalloidin与CellMask Deep Red plasma membranes stain分别标记了细胞核，线粒体，微丝和细胞膜（图4）；第二幅是用LC3B antibody with Alexa Fluor 350，ER-Tracker Red，tubulin antibody with Alexa Fluor 647与NBD C6-ceramide分别标记了自噬小体，内质网，微管和高尔基体（图5）。这个小工具非常适合对荧光染料的激发光发射光参数不熟悉或不敏感的人，可以通过颜色带来直接挑选和搭配自己想要的染料，十分直观。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/12/201012081706_265545_1856701_3.jpg图4. 细胞核，线粒体，微丝和细胞膜染色仿真效果图http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/12/201012081707_265546_1856701_3.jpg图5. 自噬小体，内质网，微管和高尔基体染色仿真效果图（一）、荧光染料选购原则 现在针对某一种物质或结构，各个厂商都会有多种荧光染料供大家选择，选购时需要注意以下事项：1. 根据现有滤色块或激光器进行选择，或者根据新买的染料再重新配一个滤色块；2. 多色荧光成像时，要尽量避免染料之间的窜色，同时还要避开样品自发荧光的影响；3. 染料的物理化学性质，优先考虑稳定性和抗淬灭性强的染料，离子荧光染料尽量选择Km值大的染料，对细胞内的离子浓度缓冲作用小；4. 尽量选择负载后不会改变细胞的生理生化状态，或对细胞无毒副作用的染料；5. 根据自己的实验需求是染活细胞还是固定细胞，选择相对应的染料，有时还要考虑染料能否经受醛类物质的处理；6. 包装形式：很多染料厂商会提供粉末和溶液两种形式，尽量选择粉末形式的，粉末的稳定性和保质期一般要比溶液长很多，而且尽量选择多管分装的粉末。7. 厂商选择：如果经费充足的话就首选MP的吧，其次再考虑Sigma，Roche等其他公司，国产知道的有碧云天，凯基等等。（二）、荧光染料配制及操作注意事项1. 详细阅读厂商提供的说明书，了解该染料的详细信息，严格参照操作指南进行配制；2. 如果是多管分装的粉末，每次配一管，配成适当高浓度的母液，然后再分装成几小管，每管10~20微升，小管封口，避光，低温保存，尽量避免反复冻融，每小管依照次序用完后再另开新的小管；4. 用母液配制的工作液尽量现配现用，染色过程尽量避光；5. 第一次使用某染料时，必须根据说明书或参考文献，进行染色浓度和染色时间摸索，以确定最佳染色条件；6. 为了增强染料的负载效率，可适当进行抽真空，或者添加微量的表面活性剂（如0.005% silwet，Triton X-100等等）；7. 染完色后，用培养液或缓冲液洗涤几次，以降低背景荧光强度；8. 染色完成后及时进行观察，适时使用些抗淬灭剂以增强染料的光稳定性。三、荧光滤色块类型的选择 荧光滤色块（Filter cube），又称荧光滤片组（Filter set），一个完整的荧光滤色块由激发光阻滤片，发射光阻滤片和二向色镜（分色镜）三部分组成，模块侧面标有这三块滤色片的光谱参数（图6，图7）。http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/12/201012081709_265547_1856701_3.jpg图6. 荧光滤色块构造，45度斜躺着的是二向色镜http://ng1.17img.cn/bbsfiles/images/2010/12/201012081710_265548_1856701_3.jpg图7. 荧光滤色块构造，左侧面是激发光阻滤片，上顶面是发射光阻滤片 图8展示的是Observer Z1中的六孔荧光转盘，其中两点，八点，十点和十二点钟方位分别装有一个荧光滤色块，四点钟方位装着DIC模块，空着的六点钟方位是来看明场和相差的。使用时通过转动转盘来进行观察模式切换。