质谱显微镜

相衬显微镜的定义及与普通显微镜的区别： 相衬显微镜是一种特殊的显微镜，特别适用于观察具有很高透明度的对象，例如生物切片、油膜和位相光栅等等。光波通过这些物体，往往只改变入射光波的位相而不改变入射光波的增幅，由于人眼及所有能量检测器只能辨别光波强度上的差别，也即振幅上的差别，而不能辨别位相的变化，因此用普通显微镜是难以观察到这些物体的。 ------------------------------------- 透明度很高的物体，也称为位相物体。相衬法（也叫位相反衬法）是通过空间滤波器将物体的位相信息转换为相应的振幅信息，从而大大提高透明物体的可分辨性，所以从这个意义上说，相衬法是一种光学信息处理方法，而且是最早的信息处理的成果之一，因此在光学的发展史上具有重要意义。1935年泽尔尼克根据阿贝成像原理，首先提出位相反衬法，由改变频谱的位相以改善透明物体成像的反衬度，1953年泽尔尼克因此获诺贝尔物理学奖。这是诺贝尔物理学奖中少数几项与光学有关的奖项之一 ----------------------------------------- 工作原理： 实际的做法可以是，在玻璃基片的中心处加一滴液体，液滴的光程引起一定的相移，这样就形成了一块位相板，将这块位相板放置在显微镜的后焦面上，当作一个空间滤波器。在相干光的照射下，像面上出现与物的位相信息相关的图像。像面上的强度分布与样品位相成线性关系，也就是说，样品的位相分布调制了像面上的光强。 相衬法不是在使用显微镜的过程中发现的，而是泽尔尼克在工作于别的光学领域时发现的。这要从1920年泽尔尼克对衍射光栅产生兴趣时说起。这种反射式光栅是由平面或凹面镜片构成，镜片表面上刻有大量等距的刻痕。刻痕位置稍有差错，就会明显影响光栅的光学效果。刻机周期性重复出现的误差，使光程差发生相应的变化，观察者在观察镜面时，就会看到镜面似乎变得起伏不平。光栅表面细致的刻线直接用肉眼是看不见的，看到的只是在镜面上出现相隔较宽的粗线。用这样的光栅所形成的光谱，往往在每根强度谱线两侧伴随有一系列杂乱的弱线，这就叫“罗兰鬼线”。一块完善的光栅，像手掌那么大，拿在手里，在均匀照明之下，看上去色彩丰富，斑斓绚丽，展现出可见光谱里的各种颜色。可是，实际上有的光栅看上去却是“伤痕”遍布，在彩带上叠加了一条条粗线。1902年阿伦（H.S.Allen）曾宣称，这些粗线不是真实的，乃是主要谱线与其鬼线互相干涉抵消的结果。1920年泽尔尼克在研究光栅时，对这一说法表示异议。他认为这些带“伤痕”的表面视场要比照像底片拍摄所得的光谱照片提供了更多信息，表面视场给出了鬼线的相对位相，而照片丢失了鬼线的位相信息。泽尔尼克这时正在从事统计物理学研究，就把这一问题放在心里，留待以后研究。 大约在1930年，泽尔尼克的实验室得到了一块大凹面光栅，安装在支架上准备使用。很快人们就看到了光栅表面的“伤痕”。由于光栅距人眼6m，看不清楚，泽尔尼克试着用一台小型望远镜观察它。这时不期而遇的事情发生了。线条状的伤痕看得非常清楚，可是当把望远镜精确聚集在镜面表面时，线条却消失无遗！怎么回事？泽尔尼克想起了10年前的思考，他意识到这一现象的重要意义，立刻集中精力研究这个光学问题。他借助于阿贝的成像理论，经过一系列实验和计算，终于作出了成功的解释。原来这是由于波的位相差所引起的干涉现象。1935年，泽尔尼克进一步根据位相理论研究出了位相反衬法，发明了相衬显微镜。在他的第一次设计中，使用一个直线条带样的孔径光阑，并在物镜的后焦面放置一个相应的直线条带光阑。泽尔尼克在他的诺贝尔领奖词中提到这一发明的偶然性时说：“然而，这个装置使物体结构的显微像显示了晕，因为衍射效应使物体细节的带状物像——沿垂直于带的方向散开，从而使像上的小亮点成为短线段状。为了避免这种观象，我改用了环状光阑，此光阑导致晕圈向各方向散开，不过晕圈变得很微弱以致实际上完全没有意义。” 现在全世界生产相衬显微镜的公司很多，相衬显微镜已经广泛应用于生物学及医学方面作细菌学和病理学的研究，也在矿物晶体微形貌学中得到了有效的应用。用这种特殊的显微镜，可以进行晶体表面生长的动态观察。 其实相衬显微镜就是我们平时所说的相差显微镜。它是根据光线通过不同密度的物质时，其滞留程度不同（密度大则滞留时间长）的原理设计的。 相差显微镜，可以将这种光程差或相位差，转换成振幅差，增强对比度。它与普通光学显微镜最主要的不同点是在物镜后装有一块相差板，由于相差板上部分区域有吸光物质，通过其的偏转光线之间又增加了新的光程差，从而对样品不同密度造成的相位差起了“夸大”作用。最后两组光线通过透镜会聚成一束，发生相互叠加或抵消的干涉现象，从而表现出肉眼明显可见的明暗差别。 由于反差是以样品的密度差别为基础形成的，故相差显微镜的样品不需染色，可观察活细胞，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。

共聚焦显微镜与普通光学显微镜的比较显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。普通光学显微镜与激光共聚焦显微镜同属于光学显微镜。　　一、普通光学显微镜　　普通生物显微镜由3部分构成，即：①照明系统，包括光源和聚光器；②光学放大系统，由物镜和目镜组成，是显微镜的主体，为了消除球差和色差，目镜和物镜都由复杂的透镜组构成；③机械装置，用于固定材料和观察方便。　　显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的分辨力（resolution）有关，分辨力是指显微镜（或人的眼睛距目标25cm处）能分辨物体最小间隔的能力，分辨力的大小决定于光的波长和镜口率以及介质的折射率，用公式表示为：　　R=0.61λ /N．A． N．A．＝ｎsinα/2　　式中：n=介质折射率；α=镜口角（标本对物镜镜口的张角），N.A.=镜口率（numeric aperture）。镜口角总是要小于180?，所以sina/2的最大值必然小于1。　　制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65~1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05~0.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。　　普通光线的波长为400~700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。

1、荧光显微镜的照明方式通常为落射照明，即光源通过物镜投射于样品上；2、荧光显微镜的光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；3、荧光显微镜有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人眼。 荧光显微镜用于研究细胞内物质的吸收、运输、化学物质的分布及定位等。 细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜就是对这类物质进行定性和定量研究的工具之一。