纯化

p　　strongspan style="color: rgb(31, 73, 125) "超速离心的差速沉淀及等密度梯度离心法/span/strong/pp　　无论是国际顶级杂志的文献统计，还是国内用户的私下调研，超速离心一直都是作为外泌体或者说胞外囊泡分离纯化的金标准而存在。伴随着外泌体的发现、研究深入和产业转化，不断有各种“替代”方法、试剂盒出现，试图挑战超离在外泌体分离纯化方式中的领导地位，但至今仍未有成功。究其原因，超速离心也许是唯一一个可以同时用两个不同维度对外泌体进行分离纯化的实验方法。/pp　　每一种颗粒，例如外泌体，都会有其自身的一定特定属性，例如特定的大小区间、一定的密度范围、也许还有某些特别的表面标记物等等。以上每一种属性，只要能够与其他的颗粒存在足够的区分度，我们就可以相对应想办法进行识别和分离，这就构成了近百年来分子生物学的种种纯化手段。/pp　　以超速离心为例，其核心原理为沉降平衡方程：/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201806/insimg/0f433fe1-85c9-43f2-9e09-d27552a46652.jpg" title="1.png"/img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201806/insimg/ac34f1d2-2ece-4c7e-939b-988f7f3f7ce1.jpg" title="2.png" width="300" height="366" border="0" hspace="0" vspace="0" style="float: right width: 300px height: 366px "/　　/pp style="text-indent: 2em "v为每个颗粒在离心过程中的瞬时移动速度，d是颗粒直径， σ是颗粒密度，ρ介质液密度，?介质液年度，ω2r为转速及所处离心半径 /pp　　当两个或多个颗粒的直径d有显著差异时，其离心沉降速度也将会有较明显差别。直径大的颗粒很快就可以沉淀下来，而更小的颗粒需要更大的离心力或者更长的离心时间才可完成沉降。这就是我们最常用的差速沉淀的基本原理。例如10万xg离心1-3小时，就是最常见的把100nm左右的颗粒沉淀下来的实验条件。/pp　　但一种方法不可能是万能，当不同颗粒的大小比较接近时，基于大小的分离方法就会出现误差，把不同的颗粒都一起分离下来，虽然已经把过大或者过小的颗粒去除，但如果类似大小的杂质颗粒过多，实际上这也只能算是分离富集，而不能算作纯化。/pp　　为此，离心专家们又开发了另一种实验方案，人为地制造不同的介质液密度区间。基于上述沉降速度方程，每一个颗粒最终将会停留在跟它本身密度相同的位置。由于介质液按实验需要铺设成连续或不连续分布，最终不同样品也会根据密度的差异，形成不同的区间性分布。外泌体由于其脂膜结构(密度~1g/ml)包裹了一定量的核酸(密度1.4~1.7g/ml)及蛋白(密度1.2~1.4g/ml)，导致其平均密度区间为1.13~1.19g/ml左右(实测值)。通过铺设不同的介质液分层，例如通过不同浓度的OptiPrep/蔗糖/TE Buffer，我们就可以人为的仅把符合此密度区间的颗粒给筛选出来。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201806/insimg/d813137b-fb44-4826-b814-626f12a8d2ec.jpg" title="3.png"//pp　　不同的胞外囊泡，拥有不同的大小和密度分布区间，这类物理属性是我们在研究生物颗粒时最直观也是最准确的表观参数。超速离心法，正式通过大小和密度两个不同的维度，根据实验的需要，一步步地把我们所要重点研究的外泌体颗粒，从纷繁复杂的体液环境中、从不同的胞外囊泡中分离、富集和纯化下来。/pp style="text-align: center"img src="http://img1.17img.cn/17img/images/201806/insimg/4f8ecfd3-926d-4a24-9385-f9f77097ef19.jpg" title="3.jpg"//pp　　下一期，我们将进一步对比分析其他基于试剂盒或其他实验原理的外泌体分离纯化方法，从中找出最适合我们不同实验所需的实验方案，以及超速离心为什么始终被认为是金标准的原因，敬请期待！/p

一、微孔过滤法微孔过滤法包括三种类型：深层过滤(depth)、筛网过滤(screen)及表面过滤(surface)。深层滤膜是以编织纤维或压缩材料制成的基质，利用随机性吸附或是捕捉方式来滞留颗粒。筛网滤膜基本上是具有一致性的结构，就像筛子一般，将大于孔径的颗粒，都滞留在表面上(这种滤膜的孔径大小是非常精确的)，而表面过滤则是多层结构，当溶液通过滤膜时，较滤膜内部孔隙大的颗粒将被滞留下来，并主要堆积在滤膜表面上。由于上述三种滤膜的功能不同，因此对滤膜之间的分辨非常重要。由于深层过滤是一种较为经济的方式，可去除98%以上的悬浮固体，同时保护下游的纯化单元不会败坏或堵塞，因此通常被作为预过滤处理。表面过滤可去除99.99%以上的悬浮固体，所以也可作为预过滤处理或澄清用。微孔薄膜(筛网滤膜)一般被置于纯化系统中的最终使用点，以去除最终残留的微量树脂碎片、碳屑、胶质颗粒和微生物。例如：0.22μm微孔滤膜，其可滤过所有的细菌，通常用于将静脉注射用的液体、血清及抗生素进行除菌用。二、活性碳吸附法有机物可能是阳离子、阴离子或非离子性的物质，离子交换树脂可去除原水中一些可溶性的有机酸和有机碱(阴离子和阳离子)，但有些非离子性的有机物却会被树脂包覆，这过程称为树脂的“污染阻塞”现象，不但会减少树脂的寿命，而且降低其交换能力。为保护离子交换树脂，可将活性碳过滤器安装在离子交换树脂之前，以去除非离子性的有机物。活性碳的吸附过程是利用活性碳过滤器的孔隙大小及有机物通过孔隙时的渗透率来达到的。吸附率和有机物的分子量及其分子大小有关，某些颗粒状的活性碳较能有效的去除氯胺。活性碳也能去除水中的自由氯，以保护纯水系统内其他对氧化剂敏感的纯化单元。活性碳通常与其他的处理方法组合应用。在设计纯水系统时，活性碳与其他相关纯化单位的相关配置，是一项极为重要的项目。三、反渗透法反渗透(RO)法是可达到90%~99%杂质去除率中最经济的方法。RO膜的滤孔结构较UF膜还要致密，RO膜可去除所有的颗粒、细菌以及分子量大于300的有机物(包括热源)。RO膜的滤孔结构较UF膜还要致密，RO膜可去除所有的颗粒、细菌以及分子量大于300的有机物(包括热源)。当二种不同浓度的溶液，由一个半透膜隔开时，渗透现象会自然发生。渗透压将水压过半透膜，水将浓度较高的溶液稀释，后造成浓度平衡。在水纯化系统中，施加压力于高浓度的溶液中，以抗衡渗透压。如此迫使得纯水由高浓度的液体通过RO膜，并可加以收集。由于RO膜致密度极高，因此，产出的水流很慢，需要经过相当的时间，贮水箱内才会有足够的水量。RO膜可执行离子排除，使得只有水可通过RO膜，其余所有的离子及溶解的分子都被截留，并加以排除(包括盐类和糖)。RO膜以电荷反应将离子排除，带电荷愈大，排除性愈高，所以RO膜几乎可排除所有的(99%)强离子性的高价离子，但是，对于弱离子性的单价离子(如钠离子)的效果只有95%。不同的进水需要不同种类的RO膜，RO膜包括由乙酸纤维酯制成，或是以聚硫胺与聚砜基质的混合薄层聚合物。如果以原水水质及产水水质为基准，经过适当设计后，RO是将自来水纯化的最经济有效方法。RO同时也是试剂级纯水系统很好的前处理方法。四、离子交换法离子交换法是以圆球形树脂(离子交换树脂)过滤原水，水中的离子会与固定在树脂上的离子交换。常见的两种离子交换方法分别是硬水软化和去离子法。硬水软化主要是用在反渗透(RO)处理之前，先将水质硬度降低的一种前处理程序。软化机里面的球状树脂，以两个钠离子交换一个钙离子或镁离子的方式来软化水质。离子交换树脂利用氢离子交换阳离子，而以氢氧根离子交换阴离子；以包含磺酸根的苯乙烯和二乙烯苯制成的阳离子交换树脂会以氢离子交换碰到的各种阳离子(例如Na+、Ca2+、Al3+)。同样的，以包含季铵盐的苯乙烯制成的阴离子交换树脂会以氢氧根离子交换碰到的各种阴离子(如Cl-)。从阳离子交换树脂释出的氢离子与从阴离子交换树脂释出的氢氧根离子相结合后生成纯水。阴阳离子交换树脂可被分别包装在不同的离子交换床中，分成所谓的阴离子交换床和阳离子交换床。也可以将阳离子交换树脂与阴离子交换树脂混在一起，置于同一个离子交换床中。不论是那一种形式，当树脂与水中带电荷的杂质交换完树脂上的氢离子及(或)氢氧根离子，就必须进行“再生”。再生的程序恰与纯化的程序相反，利用氢离子及氢氧根离子进行再生，交换附着在离子交换树脂上的杂质。若将离子交换法与其他纯化水质方法(例如反渗透法、过滤法和活性碳吸附法)组合应用时，则离子交换法在整个纯化系统中，将扮演非常重要的一个部分。离子交换法能有效的去除离子，却无法有效的去除大部分的有机物或微生物。而微生物可附着在树脂上，并以树脂作为培养基，使得微生物可快速生长并产生热源。因此，需配合其他的纯化方法设计使用。五、EDI纯水技术电渗析(EDI)是一项结合了离子交换树脂和离子选择性通透膜，并结合直流电去除水中离子化杂质的技术。该项技术的发展克服了离子交换树脂的局限性，特别是离子交换柱耗竭时离子杂质的释放及重填或再生离子交换柱的工作。水通过一个或多个在阳离子或阴离子选择膜之间填满离子交换树脂的管腔，在电场的作用下，离子在离子交换树脂间向管腔的两侧移动并进入另外的管腔，这个过程中也会电解产生维持树脂处于再生状态所需的H+和OH- 。流向两侧独立管腔的离子被水冲刷掉。六 、超滤法超滤（UF）是一个过滤术语，指能去除如蛋白质大小的颗粒的过滤器。膜孔径通常在1-50nm之间，中空纤维结构的超滤膜通常有较高的滤过速率。超滤膜根据其降低相关污染物浓度的效率来分级微孔薄膜是依其孔径大小来去除颗粒，而超滤(UF)薄膜则是一个分子筛，它以尺寸为基准，让溶液通过极细微的滤膜，以达到分离溶液中不同大小分子的目的。超滤膜是一种强韧、薄、具有选择性的通透膜，可截留大部分某种特定大小以上的分子，包括：胶质、微生物和热源。较小的分子，例如：水和离子，都可通过滤膜。所以，超滤法可将截留液中的大分子加以浓缩，但是，仍有些大分子会渗漏至滤过液中。超滤膜有数种不同的范围，在所有的实例中，超滤膜会留在大部分大于其分子筛所定义分子量的分子。七 、紫外线照射法紫外线照射法已广泛的使用在水处理上，低压水银灯所放射出来的254nm的紫外线是一种有效的杀菌方法，因为细菌中的DNA及蛋白质会吸收紫外线而导致死亡。近来在UV灯制造技术方面的进步，已可制造同时产生185nm和254nm波长的紫外灯管，这种光波长组合可利用光氧化有机化合物，接着这种特殊灯泡，将纯水中的总有机碳浓度降低至5ppb以下。八、蒸馏法蒸馏法是通过改变水的形态，从液态到气态再回到液态，将水和污染物分离。蒸馏法的每一个转换过程都为纯水与污染物的分离提供了机会。理论上，除蒸汽压力与水接近的物质和共沸化合物，蒸馏法能去除所有种类的水中污染物。像RO一样，蒸馏法生产纯水的速度较慢，所以蒸馏水必须先储存起来以备日后使用。蒸馏水器非常耗电，每生产1升纯水通常耗费1KW电力。依据蒸馏水器的不同设计，蒸馏水的电阻率大约能达到1 MΩ-cm，因为空气中的CO2会溶入蒸馏水中迅速降低其电导率。新鲜蒸馏水是无菌的，但如果保存不当，一段时间后就不再是无菌的了。九、凯得菲(KDF)凯得菲(KDF)的作用及功效：凯得菲(KDF)是高纯度的铜/锌合金颗粒，它通过微电化学氧化-还原反应(Redox)进行水处理工作，在与水接触时，合金中的两种金属在亚微观尺度上构成无数小的原电池系统，这种材料在水中具有强大的反应能力和极快的反应速度，可以清除水中高达99%的氯和水中溶解的铅、汞、镍、铬等金属离子和化合物。对抑制细菌、真菌、污垢、水藻的滋生效果卓著。被用于预处理、主处理与废水处理设备。凯得菲(KDF)完善或取代现有技术，可大辐度延长了系统寿命，减少重金属、微生物、污垢，降低了总费用，减化系统维护。(1) 去除强氧化剂(余氯)凯得菲(KDF)具有强大的还原能力，能去除水中的各种强氧化剂，对余氯特别有效。(2)去除重金属凯得菲(KDF)处理介质可以去除水中的多种重金属离子，如铅、汞、铜、镍、镉、砷、锑、铝和其他许多可溶性重金属离子，它们的去除是通过置换反应和物理和化学吸附反应来完成的。凯得菲(KDF)去除重金属离子的机理如下：金属离子吸附于凯得菲(KDF)处理介质的表面并与凯得菲(KDF)中的锌发生置换反应，生成的金属或吸附在凯得菲(KDF)表面，或进入凯得菲(KDF)晶格中，从而使有毒重金属污染物结合在凯得菲(KDF)上。例如，水中溶解的铅离子还原成不溶性的铅原子，并吸附于凯得菲(KDF)介质的表面,汞离子与凯得菲(KDF)也发生类似的反应，X射线衍射研究发现汞的去除是形成了铜－汞合金。(3)去除硫化氢在应用膜法进行水处理时，如果选用地下水作水源，水中可能存在硫化氢，硫化氢如被氧化成硫磺就会污染滤膜表面，凯得菲(KDF)过滤介质有去除硫化氢的功能，生成的硫化铜不溶于水，可在凯得菲(KDF)介质反冲洗时去除(4)减少悬浮固体凯得菲(KDF)处理介质的颗粒平均尺寸大约为60目，最小的颗粒约110目，也能起到物理过滤去除悬浮物质的作用，通常凯得菲(KDF)过滤介质能够有效地去除直径小于至50μm的颗粒。(5)减少矿物质结垢(6)抑制微生物繁殖凯得菲(KDF)处理介质不是通过一种机理、而是几种机理控制微生物的生长繁殖，通过每一种的单独作用或协同作用来达到抑制微生物的作用。主要机理包括：氧化还原电位的变化，氢氧根离子和过氧化氢的形成，介质中锌的溶出等。在一般情况下，凯得菲(KDF)处理介质作为反渗透膜的预处理手段时，能够抑制细菌、藻类等微生物的繁殖，从而防止了微生物对膜的破坏。【本文由和泰仪器发布，未经允许，禁止转载、抄袭！部分内容整理摘编自网络，如有侵权,请联系改正！】

流动化学创新地将传统独立分开的合成操作过程整合起来，在连续流动的系统中完成化学反应，加快了合成的速度，对于绿色化学和实验室自动化领域具有非常重要的意义。此前，我们与爱丁堡赫利瓦特大学 VilelaLAB 和流动化学实验室进行合作，借助 Advion Interchim Scientific puriFlash5.250 纯化制备系统，搭建了全新的连续分离纯化平台，进一步加快实验流程。AIS puriFlash5.250 纯化制备系统ONE平台搭建 平台大致上分为三部分：流动反应池部分、在线输送部分以及AIS puriFlash 5.250 制备纯化部分。实验平台搭建示意图ONE基本思路step 1：流动反应池系统用于进行合成并将粗反应混合物直接或通过在线萃取器输送到 AIS puriFlash 5.250 色谱仪的进样口处。step 2：puriFlash 5.250 通过仪器的 10 通阀，将原料交替切换注入到其中一个样品环中。step 3：两根相同的色谱柱：一个加载反应混合物，另一个用于平衡和执行色谱方法，确保样品环中的样品不损失。 step 4：使用 UV＋ELSD 检测器监测并进行馏分收集。 ONE 实验关键点1、优化流动反应池的设置，以获得产品的最大产率；2、优化纯化方法，尽量减少离线实验中粗反应混合物纯化所需的时间；3、色谱方法与流动反应池的进料流速同步，以实现成功的耦合。ONE应用实例(A) 乙二醇和苯甲酰氯酯化反应的在线快速纯化流程示意图。 (B) 40 个连续分离的酯产物的色谱堆叠图。DMAP：4-（二甲氨基）吡啶，FBR：固定床反应器。 实验体系证明了流动化学集成 puriFlash 5.250 从粗反应混合物中同时分离两种产品（以克/小时为单位，纯度 99%）的潜力。在乙二醇和苯甲酰氯的连续流动酯化中，两种酯的产率分别为 9.9 和 7.6 mmol/h。ONE讨论 使用测试混合物(4-甲氧基苯酚和2,5-二溴对二甲苯，正己烷/乙酸乙酯体系)成功进行了原理验证研究，证明了流动化学-puriFlash5.250集成的可行性，并确认了 Advion Interchim Scientific Flash 柱的耐用性。 受到该方法成功的启发，另外几种不同的反应也得到了验证，连续分离出纯度为 97-99% 的产品。 除此之外，puriFlash 5.250 纯化制备系统还可以提供重要的辅助功能。 • 以4,7-二苯基-2,1,3-苯并噻二唑为均相光敏剂，催化 fmoc-l-蛋氨酸生成相应的亚砜为例，证明了均相催化剂在线回收的可能性。 • 可以实现 AIS puriFlash 纯化制备色谱系统与您的流动化学无缝集成，这种联合能够满足实验需求，有助于加速化学新反应的发现。