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关键词(必填项目):胚胎干细胞培养目的(必填项目):正确规范胚胎干细胞培养背景知识(选填项目):无。原理(选填项目):无主体内容:目录一、细胞二、一般培养-保持胚胎干细胞处于未分化状态培养基细胞复苏冻存细胞明胶包被细胞传代三、体外分化培养基包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板(使用或不使用盖玻片)体外分化方法四、移植细胞的准备细胞多能性胚胎干细胞产生于小鼠胚泡1.表达绿色荧光蛋白(EGFP)的B5-ES细胞。由Dr. Nagy的实验室制备。2.D3-ATCC; CRL-1934. 我们得到时大约传了17代。3.J1-由Dr. Jaenish的实验室友情提供。我们得到时大约传了7-9代。4.J1rtTA-rtTA表达J1细胞,由Dr. Jaenish的实验室友情提供。5.表达黄色荧光蛋白的YC5-ES细胞,由Dr. Nagy的实验室提供。一般培养--维持ES细胞处于未分化状态ES细胞培养用含有ESGRO(白血病抑制因子)的高糖培养基来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1%明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2-3天从达到80%-90%融合的平板按1:8的比率传代细胞一次,细胞传代以后,在将细胞接种在0.1%明胶包被的培养皿之前,通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时,使分化细胞粘附,从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃,5%CO2,100%湿度条件下培养。培养基ES:配制一20×不含DMEM,HS,ESGRO的溶液(该溶液也能用于EB培养基--见下文)。分装在50ml FALCON管中,(稀释为2×,每管42ml),贮存在-20℃。通过将21ml该溶液,HS和ESGRO加入450mlDMEM中制备培养基,0.2μm滤膜过滤。贮存于4℃。 注:一瓶DMEM是500ml。贮存液 DMEM(高糖) [/s
简单介绍一下细胞培养技术,本人这段时间主要做细胞工作,和大家共勉吧!细胞培养技术一、细胞培养的条件和要求 二、细胞分离 三.体外培养细胞龄的计算四.细胞鉴别试验 五、细胞计数六、细胞传代 七、细胞的冻存和复苏 八、细胞培养用水处理 九、选择小牛血清的微量细胞培养检查法 十、葡萄糖测定法 十一、乳酸测定法十二、细胞培养方式
体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理(如缺血、缺氧)、化学和生物因子(如神经营养因子)等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制,药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。 我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作,取得了一些经验,现将培养细胞分类及方法简要介绍如下:一.鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子(NGF)等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。1. 材料和方法 (1)选正常受精的鸡蛋,置于37℃生化培养箱内孵化,每日翻动鸡蛋一次。 (2)取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳,从气室端敲开蛋壳,用消毒镊剥除气室部蛋壳。(3)用弯镊钩住鸡胚颈部,无菌条件下取出鸡胚置小平皿内,除去头部后,腹侧向上置 灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔,除去内脏器官。(4)在解剖显微镜下,小心除去腹膜,暴露脊柱及其两侧,在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧 排列的背根节(图1),用一对5号微解剖镊小心取出。(5)置背根节于解剖溶液内,用微解剖镊去除附带组织,接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料 培养瓶中,在DMEM无血清培养液中培养。2. 结果鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S,20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。二.新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养背根神经节(DRG)细胞起源于神经嵴,NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明,外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外,分离培养的神经节在NGF存在的情况下,神经突起的生长在一天之内可长达数毫米,因此,利用培养的DRG细胞,进行轴突生长发育的研究,是最为经典而常用的方法之一。