单细胞活性分析

p 　　近日，国家自然科学基金委员会化学科学部在北京召开了2017年度“科学仪器基础研究专款”项目结题验收会。唐波教授作为山东师范大学获批的首个科学仪器基础研究专款项目“适用于单细胞内活性小分子物种检测的荧光分析仪”的负责人参加会议，并进行结题汇报。 /p p 　　该项目在以活性小分子为重点对象的新型荧光探针研究的基础上，以设计的多功能微流控、单细胞分析芯片、双激光诱导荧光三色检测以及信号采集与系统控制等关键技术为单元模块，研制出了适用于单细胞内活性小分子物种检测的荧光分析仪 建立了单细胞内浓度差别大的多种重要小分子(活性氧、活性氮、巯基化合物、金属离子等)的同时定量检测新方法，获取了单细胞内这些活性小分子的含量、水平变化与细胞分子事件的相关性信息。 /p p 　　项目研制的仪器，解决了目前商品化荧光光谱仪不适应单细胞、激光共聚焦与流式细胞仪难以准确定量单细胞内活性小分子的不足，为单细胞分析、小分子检测等领域提供了一种重要的科学仪器。项目建立的分析方法，突破了难以同时获取单细胞内多种重要小分子定量信息的瓶颈，将在单细胞水平上为活性小分子相关的生理病理机制研究提供一种全新的分析方法。项目执行期间发表SCI论文74篇，总引用1676次 申请发明专利14件，授权5件 研究成果获得省部级奖励2项，并在人才培养方面取得了显着成效。 /p p 　　验收专家组听取了项目负责人的汇报，审阅了相关资料，观看了研制仪器核心部件及仪器正常工作状态的录像，经质询、评议，认为该项目研究工作全面完成了研究计划，取得了突出进展，以综合评价优秀的优异成绩通过验收。 /p p br/ /p

2020年11月，哈尔滨工业大学城市水资源与环境国家重点实验室邢德峰教授团队应用辰英核心产品——拉曼单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS-R300，在期刊《Science of the Total Environment》上发表文章“Mini-metagenome analysis of psychrophilic electroactive biofilms based on single cell sorting”。相关文章链接一、研究背景微生物群落的活性对生物电化学系统（BES）中的细胞外电子转移（EET）过程具有重要影响，而了解这些复杂的微生物代谢相互作用是一个巨大的挑战。温度是影响细菌活性和胞外电子转移效率的主要环境因素之一。嗜冷电活性细菌的代谢功能对于研究低温（4-15℃）下细胞外电子转移（EET）机制具有重要意义。本研究采用拉曼细胞分选耦合高通量测序技术，准确获得嗜冷细菌群落的基因信息。首次通过拉曼光谱聚类分析，精准识别出杆菌属目标类群，并通过mini-metagenome测序分析，获知生物膜群落中膜运输功能基因ftsEX的相对丰度较高，说明其对低温的适应有助于电活性细菌在低温下生存；基础代谢如柠檬酸循环和糖酵解途径为胞外电子转移过程提供电子，高丰度铁(iii)转运系统基因的鉴定表明它们存在于电子转移过程的主动代谢反应中，细胞色素c（coxA和cox1）可能参与胞外电子转移。本研究揭示了嗜冷地杆菌在低温下具有细胞色素c介导的有效EET。二、实验设计mini-metagenome具有单细胞分辨率、低复杂度和高通量等优点，非常适合环境样本。在本研究中，作者通过单细胞拉曼分选获得了嗜冷微生物Geobacter，通过MDA扩增获得mini-metagenome。通过结合SCS和宏基因组测序，进而对嗜冷EABs的代谢功能有了更深入的了解。三、结果与讨论1. 单细胞分选和分类鉴定嗜冷微生物燃料电池（MFC）的电压持续时间曲线如图1A所示，峰值电压达到0.419~0.448 V。对运行至300天的嗜冷MFC中的微生物群落进行了基于16S rRNA基因的扩增子高通量测序，分析了嗜冷阳极生物膜的细菌群落结构。分析表明，大多数优势种群属于地杆菌属 Geobacter（相对丰度为68.29％）（图1B）。Fig.1 嗜冷MFC的电压持续时间曲线（A）和原始生物膜的群落结构（B）。结合拉曼光谱对35个具有短杆状形态的细菌细胞进行了检测，并通过依照其拉曼图谱进行的聚类分析将它们分为3个聚类组别（图2A和B）。单细胞拉曼分选后，目标菌从分选芯片上调入接收器中，其他菌保持不变(图2C和D)。Fig.2 基于拉曼光谱的嗜冷微生物单细胞聚类分析。不同簇的拉曼光谱(A)和聚类分析图(B)，分选前(C)和分选后(D)。分离菌成功获得基因组DNA，并通过16S rRNA基因扩增验证(图3)。Fig.3 分选细胞的基因组扩增(A)和PCR验证(B)。通过16S rRNA基因测序确定了mini-metagenome（聚类组别）的群落组成。从三个拉曼聚类组别样本中获得了超过100,000个高质量的16S rRNA基因有效reads。 Chao1以及Shannon和Simpson多样性指数表明，Cluster2的丰富度和物种均匀度比其他簇最低（Table 1）。Table 1. 16S rRNA基因测序分析不同类群的群落多样性在纲水平上确定的主要菌群是Cluster1中的Alphaproteobacteria（94.41％）和Cluster2中的Deltaproteobacteria（99.97％），而在Cluster3中，GammaProteobacteria（53.16％）和Deltaproteobacteria（46.56％）占主导地位（图4A）。此外，在属水平上，不同簇之间的微生物群落组成存在实质性差异（图4B和C）。在Cluster1和Cluster2中，主要属为Sphingomonae（94.41％）和Geobacter（99.97％），而在Cluster3中，Geobacter（46.56％）和Polaromonas（44.25％）是两种主导菌属。在Cluster1和Cluster3中，本研究感兴趣的Geobacter的相对丰度分别为5.43%和46.56%。这些结果表明，Cluster2是目标细菌的准确选择，因为Geobacter的相对丰度为99.97％。随后，对Cluster2进行了宏基因组测序，以生成微型宏基因组，以研究嗜冷细菌的潜在代谢活性。Fig.4 （A）和（B）不同簇的微生物群落结构，基于OTU（C）的PCA和基于微型宏基因组（D）中代表性回收细菌的基于16S rRNA基因的系统树。2. 嗜冷微生物的mini-metagenome分析基于16S rRNA基因的系统发育研究表明，基于单细胞分选回收得到的mini-metagenome与Geobacter thiogenes 和 Geobacter lovleyi的基因组相似(图4D)。 与KEGG数据库匹配的mini-metagenome序列显示了嗜冷细菌的代谢网络和功能的概述。这表明，膜运输（membrane transport）功能在mini-metagenome中占主导地位(图5A)。Fig.5 mini-metagenome中KEGG注释基因的数量(A)和特定基因的相对丰度(B)。此外，有大量的基因参与细胞运动（cell motility）、信号转导（signal transduction）、转运（translation）和碳水化合物代谢（carbohydrate metabolism），也有很多占比的未知功能基因。为了进一步表征嗜冷EAB的潜在代谢途径，列举了一些重要代谢途径(翻译、膜运输、电子转移和能量代谢物)的功能基因(图5B)。其中，与膜转运相关的基因afuAB和ftsEX的丰度相对较高(12%)。其他相对丰度较高的基因序列包括核糖体蛋白编码基因rpsDEKM(0.33%)和rplFTOQR(2.10%)，编码cox1的细胞色素c氧化酶亚基1(1.36%)，柠檬酸循环(TCA循环)或与糖酵解相关的korABD (0.51%) icd(0.50%)和pckA(1.31%)。此外，鞭毛蛋白(fliEOZ)、电子转移黄蛋白β亚基(fixA)和细胞色素c氧化酶亚基I (coxA)相关基因的相对丰度也较低。四、结论采用单细胞分选、层次聚类分析和群落结构高通量测序、宏基因组测序相结合的方法，深入研究了嗜冷EAB的代谢功能。成功地表征了地杆菌属Geobacter的生理信息和胞外电子传递的潜在代谢途径，并实现了准确的分离。mini-metagenome表现出嗜冷MFC群落结构对低温的适应和对电位电子转移过程的主动代谢反应。细胞色素c等关键基因在低温嗜冷EAB的EET中起重要作用。文章中提到的相关仪器：辰英科仪自主研制的单细胞分选仪PRECI SCS具有独特的可视化分选功能，所见即所得，精准实现目标细胞的逐一分离。采用独特的激光与物质相互作用原理，对于复杂生物样本中形态各异的细胞，可实现非标记状态下的精准分离。对于百纳米级的单个微生物细胞也同样适用。单细胞分选仪HOOKE PRECI SCSPRECI SCS具有可视化、精准、广泛适用等特点。分选过程不依赖标记，可与形态、拉曼、荧光等多种识别方式结合，多种机型可选，满足不同应用需求。搭载潜心研制的HOOKE IntP智能软件，实现单细胞图像智能识别、一键自动分选、全自动细胞获取等。设备操作流程简易，为单细胞测序、未培养微生物开发、工程细胞筛选、细胞图谱绘制等研究提供完美解决方案，助力前沿科学研究。拉曼单细胞分选仪HOOKE PRECI SCS-R300PRECI SCS具有可视化、精准、广泛适用等特点。分选过程不依赖标记，可与形态、拉曼、荧光等多种识别方式结合，多种机型可选，满足不同应用需求。搭载潜心研制的HOOKE IntP智能软件，实现单细胞图像智能识别、一键自动分选、全自动细胞获取等。设备操作流程简易，为单细胞测序、未培养微生物开发、工程细胞筛选、细胞图谱绘制等研究提供完美解决方案，助力前沿科学研究。

p style=" text-indent: 2em " 1952年，美国细胞生物学家威尔逊曾提出，“一切生命的关键问题都要到细胞中去寻找答案。”纵观近50年来荣获诺贝尔奖生理学或医学奖和化学奖的重大突破，70多个都与细胞生物学密切相关。 /p p style=" text-align: center text-indent: 2em " img title=" 20197282317511500.jpg" style=" max-height: 100% max-width: 100% " alt=" 20197282317511500.jpg" src=" https://img1.17img.cn/17img/images/201907/uepic/8e8f4b00-dde2-40b2-8c13-4213c687f8ec.jpg" / /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " span id=" _baidu_bookmark_start_182" style=" line-height: 0px display: none " ? /span 研究团队进行相关实验 /p p style=" text-align: center text-indent: 0em " 图片来源于网络 /p p style=" text-indent: 2em " 作为研究细胞生命活动规律的科学，细胞生物学在科学家的显微镜下经历了近180年的历史，但细胞对人类来说依然是“黑箱”一般的存在。如今，研究人员正在尽力通过对单个细胞进行研究来阐明细胞的“天性”。 /p p style=" text-indent: 2em " 自2014年起，在国家自然科学基金重大项目“单细胞多组分时空分析”支持下，中国科学家在有关单细胞生物学的重大科学问题上取得了一系列进展。 /p p style=" text-indent: 2em " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 没有两个细胞是完全相同的 /strong /span /p p style=" text-indent: 2em " 如果把细胞环境比作一个社会，每个细胞就是一个独立的人。 /p p style=" text-indent: 2em " 在对人类社会的研究中，不仅个体的特征和行为值得关注，研究所处环境中个体之间相互协调或对抗作用等关系以及群体所产生的集体行为，也相当重要。细胞研究亦是如此。 /p p style=" text-indent: 2em " 多年来，通过对细胞的研究，科学家已经对生命体的生长发育、遗传变异、认知与行为、进化与适应性等若干生命科学问题有了较为清晰的认识。不过，在清华大学副教授陆跃翔看来，这些还远远不够。 /p p style=" text-indent: 2em " “在之前的研究中，科学家探索出细胞新陈代谢、生命运动过程中的各种表征方法，如蛋白表达分析、基因转录检测（反转录PCR）等，这些方法更多的是在大样本的细胞中进行观察与测量后，得到一个平均结果。”陆跃翔解释到。 /p p style=" text-indent: 2em " 然而，没有两个细胞是完全相同的。这些平均结果掩盖了细胞之间微小的差异，这些差异可能在某些关键生命过程如细胞分化、肿瘤的发展过程中起着决定性作用。 /p p style=" text-indent: 2em " 为了获取细胞生理状态和过程中更准确、更全面的信息，科研人员将目光瞄准单个细胞。 /p p style=" text-indent: 2em " “单细胞内部的生命活动，可以被认为是生物活性分子之间复杂的化学反应的结果，正是这些分子的时空分布、结构、功能及其相互作用方式，决定了细胞增殖、分化、凋亡以及重大疾病发生、发展、迁移等过程。”陆跃翔分析道。 /p p style=" text-indent: 2em " 但是想要研究这些生物活性分子形成的精密复杂的相互作用和调控网络并非易事。它不仅要求科学家了解其化学成分，更要理解它们之间相互作用的复杂过程，以及在细胞内部细胞器中特定位置的作用区域和时空变化。 /p p style=" text-indent: 2em " strong 2014年，国家自然科学基金委员会发布重大项目“单细胞多组分时空分析”申请指南， /strong 清华大学化学系教授张新荣组织的研究团队的申请获批。他们凝练出 strong 荧光探针制备与合成、新型时空分辨成像方法以及在细胞内生物分子相互作用 /strong 研究等关键科学问题。 /p p style=" text-indent: 2em " “我们希望发展建立适于单细胞中多种生物活性分子时空分辨的荧光分析新方法，驱动生命科学和基础与临床医学研究进步。”谈及科学目标，张新荣如是说。 /p p style=" text-indent: 2em " span style=" color: rgb(255, 0, 0) " strong 新技术带你深入了解“社会” /strong /span /p p style=" text-indent: 2em " 如何实现这一目标？在张新荣看来，这需要从单细胞中多组分分子的时空信息获取方法出发。为此，项目组将其分为“荧光探针制备与合成”“新型时空分辨成像方法”以及“细胞内生物分子相互作用”三大方向进行攻关。 /p p style=" text-indent: 2em " strong 要了解细胞这个独特的“社会”，首先需要的是一台可以钻进细胞内部获取关键分子信息的“放大镜”。因此，荧光探针制备与合成至关重要。 /strong /p p style=" text-indent: 2em " 针对单细胞中极低含量分子检测问题，山东师范大学教授唐波课题组综合运用共轭聚合物信号放大、无光源激发、光谱红移、核酸杂交链式放大等技术，构建了若干超灵敏的分子与纳米荧光探针，实现了细胞及活体中某些活性分子浓度皮摩尔水平的原位、动态检测。 /p p style=" text-indent: 2em " 同时，细胞中生理过程的发生和发展往往不是一类分子的孤立事件，涉及到多种分子的参与。因此课题组还开发了一系列的两组分、三组分和四组分同时检测的荧光探针，并设计了多模态探针来获取更丰富的成像信息。 /p p style=" text-indent: 2em " “本项目的一个重要特色工作是时任中国科学院上海应用物理研究所研究员樊春海课题组基于框架核酸构建的多组分分析探针和成像方法。”张新荣介绍，框架核酸是一类人工设计的结构核酸，具有尺寸精确、结构精确、修饰精确的特点，通过精确的化学修饰，可以将多种小分子及大分子探针负载到框架核酸上，实现多组分探针的可控构建。 /p p style=" text-indent: 2em " 不过，实现探针在亚细胞区域内对胞内生物活性分子的精确定位和实时检测可并不那么容易。 /p p style=" text-indent: 2em " “细胞核内分子密度大且背景荧光特别高，导致人们对单分子的观察非常困难。传统光学显微成像分辨率，不足以解析染色体DNA的构造。”陆跃翔告诉记者，尤其在超高空间分辨率的前提下，要实现持续的动态观察，对荧光探针和成像方法都提出了更大的挑战。 /p p style=" text-indent: 2em " 在活细胞超分辨成像方面，北京大学生物动态光学成像中心研究员孙育杰课题组研发了高性能探针Gmars-Q，使其在光照时进入暗态，从而延长成像时长，比已有最好探针的活细胞超分辨成像时间长一个数量级，这种超高分辨成像技术实现了纳米尺度的活细胞核内动态观测。 /p p style=" text-indent: 2em " “Gmars-Q的独特机制打开了基于蛋白结构和动力学优化荧光蛋白的设计策略。”德国卡尔斯鲁厄理工学院教授Gerd Ulrich Nienhaus曾对此给予高度评价。 /p p style=" text-indent: 2em " strong 在现代分析化学的发展中，大科学装置的应用也越来越受到科学家的重视。 /strong /p p style=" text-indent: 2em " 依托中国科学院高能物理研究所和中国科学院上海应用物理研究所的两台 strong 同步辐射光源， /strong 樊春海课题组和中国科学院高能物理研究所研究员高学云课题组开展了 strong 同步辐射X射线细胞成像方法 /strong 的研究。 /p p style=" text-indent: 2em " 实验团队通过搭建X射线全场三维成像平台，合成了一系列X射线成像探针，发展了细胞成像算法，实现了单细胞的X射线三维成像。为了应对单一技术无法在高分辨率下同时实现细胞的结构与功能定位的挑战，课题组又发展了X射线与超分辨荧光联用技术，实现了在纳米分辨下的细胞结构与功能融合成像的突破。 /p p style=" text-indent: 2em " 已有研究发现DNA不仅有序列信息，还有三维结构信息。基于此，北京大学教授、中国科学院外籍院士谢晓亮课题组通过对sgRNA改造，开发了一种全新的活细胞染色质DNA的多色、稳定标记系统，实现对活细胞内基因位点的长时间连续观察追踪。 /p p style=" text-indent: 2em " 2018年，该重大项目迎来一项重磅突破。谢晓亮课题组在《科学》上发表文章，介绍他们在单细胞水平研究双倍体哺乳动物细胞的基因组结构研究方面取得的成果。利用新发展的Dip-C技术，项目组构建了人源双倍体细胞的具有高空间分辨率的单细胞基因组三维结构。 /p p style=" text-indent: 2em " “这种结构分型对研究细胞功能有着至关重要的作用，也为唐氏综合症等染色体非整倍体疾病提供了研究和干预手段。”谢晓亮说。 /p p style=" text-indent: 2em " strong span style=" color: rgb(255, 0, 0) " 让基础研究走出实验室 /span /strong /p p style=" text-indent: 2em " 对于细胞“社会”的深层解析，不仅为了阐明各种生命现象与本质，科学家更是希望据此对这些现象和规律加以控制和利用，以达到造福人类的目的。在该重大项目支持下，诸多研究展现出了良好的社会应用前景。 /p p style=" text-indent: 2em " “许多疾病的研究和治疗最终都必须回归细胞水平。”在张新荣看来，一系列单细胞多组分时空分析技术能够有效加深人们对生命现象的本质理解，也有助于了解疾病机理，进而促进生物医药科学和相关产业的发展。 /p p style=" text-indent: 2em " strong “项目研发的诊疗一体化功能纳米探针，为相关重大疾病成因、诊断提供表征手段和依据，对疾病的早期预警以及提高疾病治愈率有着重要意义。 /strong ”张新荣讲道，部分创制的探针已经进行了市场转化，基于探针建立的荧光成像技术也成为国家重大新药创制课题中药效评价的关键技术之一。 /p p style=" text-indent: 2em " 例如，唐波课题组研究的“超高灵敏度—可逆探针”能够在活体水平上示踪炎症发生发展过程中超氧阴离子的浓度水平及动态变化过程，缩短了药物临床试验周期，提高了药物筛选效能。为即将进入临床Ⅱ、Ⅲ期的鼻敏胶囊、咳敏胶囊、结肠炎栓3个中药新品种的作用靶点、药效评价研究提供了技术支撑。 /p p style=" text-indent: 2em " 而基于同步辐射装置的X射线细胞显微成像技术，分辨率很容易达到数十纳米，可以在大视场下实现完整细胞的纳米分辨无损成像，与荧光显微装置相比具有巨大优势，在细胞显微成像方面也展现出了巨大的应用前景。 /p p style=" text-indent: 2em " 然而，对于人类来说，走进细胞“社会”是一个任重而道远的过程。还有无数未知的奥秘等着科学家去探索。 /p p style=" text-indent: 2em " 张新荣表示，该重大项目成果为下一步融合多种分析方法、发展全器官跨尺度高灵敏三维成像提供了基础。 /p p style=" text-indent: 2em " “通过研发同步辐射X射线相衬—电镜融合成像，有可能在全脑三维微米精度地图引导下选取局部特征区域进行纳米精度的结构解析，大幅降低高精度神经网络解析的盲目性。在特定位点，也可利用荧光分子成像和质谱分子解析，进一步作功能研究。”项目组成员表示，在有关“社会”的探索与发现之旅上，中国科学家一直砥砺前行。 /p