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下载地址:http://www.instrument.com.cn/download/shtml/036497.shtml本书由数十位中青年医学分子生物学专家集体编著。详细系统的介绍了基因和基因工程概论、基因组的结构、基因的转移和重组、基因表达的调控、工具酶及其应用、基因工程载体及其选用、聚合酶链反应、基因的克隆及其进展、外源基因表达系统、转基因动物、基因诊断、基因工程抗体、基因工程药物、基因治疗及基因工程疫苗等,还收录了数10种常用的分子生物学试验方法。具有简明扼要、图文并茂、可操作性强等特点。希望大家尊重原创,并在引用时,注明出处。
第一步:目的基因的制取: 用限制性内切酶直接对基因组DNA进行部分酶切,产生一系列大小不等的DNA片段。那里面含有一种或几种遗传信息的全套遗传密码。获取目的基因是基因工程操作的关键。基因工程的原料就是目的基因。所谓目的基因,是指已被或欲被分离、改造、扩增和表达的特定基因或DNA片段,能编码某一产物或某一性状。目前获取目的基因的方法主要有三种:反向转录法、内切酶切割分离法和人工合成法. 第二步:基因载体的选取: 用人工方法,取得目的基因的适宜的载体,即质粒(一种环状双链DNA)或病毒。载体一般带有必要的标志基因,以便进行检测。 基因克隆载体必须具备三个条件: a.具有能使外源DNA片段组入的克隆位点。 b.能携带外源DNA进入受体细胞,或游离在细胞质中进行自我复制,或整合到染色体DNA上随染色体DNA的复制而复制。 c.必须具有选择标记,承载外源DNA的载体进入受体细胞后,以便筛选克隆子。http://learn.gxtc.edu.cn/NCourse/swjs/gene/Images/bz1.jpg基因工程的基本过程(点击放大) 第三步:DNA的体外重组: 即用人工方法,让目的基因与运载体相结合,首先要用限制性内切酶和其他一些酶类,切割或修饰载体DNA和目的基因,然后用连接酶将两者连接起来,使目的基因插入载体内,形成重组DNA分子。这些工作都在生物体外进行,所以基因工程操作又叫体外DNA重组。 第四步:DNA重组体导入受体细胞: 将外源DNA片段与载体DNA连接形成DNA重组体,即重组DNA。 这种重组体连接的方法主要有: 粘性末端连接法:应用同一种限制性内切酶切割载体和外源DNA分子,可产生相同的粘性末端(接口处的碱基互补),进一步用DNA连接酶将断口连好,即可获得重组DNA分子。http://learn.gxtc.edu.cn/NCourse/swjs/gene/Images/zhuru.jpgDNA重组体导入受体细胞 钝性末端连接法:用化学合成法或逆转录法得到的外源DNA片段,均为钝性末端,这种末端也可以用特殊的连接酶连接,但效率太低。通常需要用人工方法加上粘性末端,再进行连接。第五步:受体细胞的繁殖扩增: 含重组DNA的活受体细胞,再在适当的培养条件下,并进行繁殖和扩增,使得重组DNA分子在受体细胞内的拷贝数大量增加。 第六步:克隆子的筛选和鉴定: 受体细胞经转化(传染)或传导处理后,真正获得目的基因并能有效表达的克隆子一般来说只是一小部分,而绝大部分仍是原来的受体细胞,或者是不含目的基因的克隆子。为了从处理后的大量受体细胞中分离出真正的克隆子,需要对克隆子进行筛选和鉴定。 第七步:目的基因的表达。
基因工程技术在食品中的运用