循环肿瘤细胞捕获仪

p style="text-indent: 2em "在过去的一年中，循环肿瘤细胞(CTC)捕获和检测市场飞速增长，多个公司将此类技术推向临床并应用于癌症的诊断，与此同时，一大批新兴公司凭借其独有技术从科研机构中脱颖而出，开启了循环肿瘤细胞捕获和检测的商业化之路。/pp style="text-align: center"img src="https://img1.17img.cn/17img/images/201901/uepic/80851a5e-ad37-4e21-86db-fe75c5d75d14.jpg" title="细胞.jpeg" alt="细胞.jpeg" width="419" height="279" style="width: 419px height: 279px "//pp　　传统上，临床医生采用组织活检进行癌症诊断。但这种方法对患者具有侵入性，不仅耗时且价格高昂。在过去的十年中，液态活检技术的发展为这些问题带来了突破性的解决方案，并有望为不同患者的疾病提供了更加精准的个体化信息。/pp　　加拿大多伦多大学生物化学教授Shana Kelley一直致力于CTC捕获和检测技术的研究，她认为，“strong液体活检将有望带来一次彻底的模式转变，因为患者可以在接受治疗的同时以一种非侵入式的方式进行持续监测/strong。这样可以监测肿瘤的动态特征，帮助医生们制定更多治疗方案，而组织活检由于技术的风险和侵入性无法做到这些。”她还表示：“strong我们发现越来越多的技术能够在单细胞水平分析CTCs的基因型和表型特征/strong。考虑到这些细胞的异质性以及追踪患者样本中目标亚群微量水平的重要性，这一点极其重要。”/pp　　一般而言，研究人员可以通过CTC的生物或物理特征(如基因表达、大小、密度、变形性或电荷)进行正向富集或负向富集，然后利用免疫、分子或功能性实验对这些细胞进行检测。虽然CTC富集和捕获技术前景广阔，但与利用ctDNA的液体活检技术相比，研究人员却遇到了挑战。/pp　　2017年发表在Cancer Discovery期刊的一项研究中，来自德国汉堡大学医学中心的Klaus Pantel及其研究团队对CTCs在液体活检领域的临床应用进行了研究，并指出了strongCTCs应用的局限性/strong：strong建立癌细胞系或异种移植需要成百上千个CTCs，这使该方法适用于极少数疾病的晚期患者身上/strong。作者还指出，对基于CTC生物学发现的新技术研发的关注，常常会延缓CTC检测进入临床诊断的进程。但研究人员也表示，有关CTC生物学的新研究已经开始衍生出“集CTCs富集、检测和定性于一体”的平台。/pp　　美国医疗和生命科学咨询公司Health Advances副总裁Kristen Amanti认为，CTCs临床应用的问题和障碍主要取决于如何使用这些细胞。“strong如果公司试图利用CTCs来进行癌症筛查，而不是监测已经被诊断出患有某种特定癌症患者的治疗，那么公司将面临更大的困难/strong。”Kristen Amanti说到，“如果没有针对特定类型癌症的筛查机制，那么在证明临床证据有效方面会很困难。如果你提前了解已有一个筛查机制，那你可能还要去证明你比这种筛查更好，或者能够提供某种经济优势。”/pp style="text-align: center "strongspan style="color: rgb(192, 0, 0) "商业化进程加速/span/strong/pp style="text-indent: 2em "虽然在临床开展上面临着不少障碍，但是CTC富集和检测的商业前景仍然十分强劲。2018年，多家公司都在CTC捕获和检测技术的临床转化方面取得了重大进步。br//pp　　美国Epic Sciences公司的CTC技术在2018年取得了一系列积极进展。2018年6月，Epic Sciences公司及合作伙伴发布了一项多机构队列研究，验证了基于CTC的AR-V7检测方法的有效性。根据该公司的信息，strong这项研究是首个证实液体活检能够预测治疗效果并显示对患者具有生存受益的研究之一/strong。此外，Epic Sciences在2018年初时曾获得5200万美元E轮融资，目前该公司正在将其技术用于研究血液中肿瘤细胞和人类免疫细胞的综合分析，进而用于免疫治疗药物的研发和伴随诊断中。2018年11月，该公司还与加拿大四家乳腺癌治疗中心合作进行了一项临床试验，以检测其技术是否能预测转移性乳腺癌患者的复发风险。/pp　　与此同时，美国液体活检公司Celsee Diagnostics在CTC富集工具商业化方面取得了进展。在与单细胞诊断公司IncellDx达成一项可行性研究合作后，Celsee Diagnostics在2018年1月份签订了一系列产品的strong联合商业化协议，包括基于CTC的乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌和其他癌种的筛查产品/strong。/pp　　2018年5月，CellMax Life公司启动了一项美国临床试验，用于验证其基于CTC的结直肠癌筛查产品。该公司CMx平台目前只在亚洲销售，采用于一种“混合微流体芯片”，能够从10亿个正常细胞背景中分离出1~10个CTCs。CellMax Life还在2018年4月份与IncellDx达成合作，共同开发和和销售几种实体瘤的CTC检测产品，用于个性化治疗方案选择和监测。近日，CellMax Life还宣布，作为公司细胞疗法临床试验的一部分，公司已经与台湾Medigen Biotech公司达成合作。Medigen将结合Cellmax Life的CMx平台及其液体活检panel，用于患者的的治疗决策及疗效监测。/pp　　另一家计划进军CTC液体活检领域的公司是Precision for Medicine。2018年9月，Precision for Medicine收购了ApoCell公司及其ApoStream CTC富集技术。strong该技术可利用介电电荷差分离肿瘤细胞和正常细胞/strong。根据Precision for Medicine公司高级副总裁Darren Davis的说法，公司收购ApoCell主要在于其开发的一款基于免疫组织化学和免疫荧光成像的新型液体活检技术。/pp　　Vortex Biosciences也在推广基于CTC的VTX-1液体活检平台方面取得了进展。该公司在2018年3月份与BioView合作开发一种整合流程，以识别CTCs的临床生物标志物。2017年11月份，该公司和Stratec Consumables签订了一项供货协议，计划开发一款适用于Vortex平台的微流体芯片。该芯片最初由加州大学洛杉矶分校(UCLA)开发，新版芯片将帮助该平台适用于商业生产规模。此外，在2018年早些时候，Menarini Silicon Biosystems公司宣布已经将最近收购的技术整合到一款细胞型液体活检流程中，其中包含CellSearch CTC纯化工具。该公司表示，CellSearchstrong利用细胞外抗原表位和免疫磁珠，以一种自动化方法从血液样本中提取肿瘤细胞/strong。/pp style="text-align: center "strongspan style="color: rgb(192, 0, 0) "初创公司潜力巨大/span/strong/pp style="text-indent: 2em "位于美国密歇根州的初创公司Akadeum计划通过公司的微气泡平台进入液体活检市场。公司称微气泡平台可以识别和分离CTCs和其他分子分离。目前Akadeum的这款工具只限于研究使用，与微流控芯片不同的是，该平台使用的是低密度的玻璃板和空气泡，气泡表面带有特定抗体，能够与靶细胞结合，然后“浮到表面”。Akadeum公司CEO Brandon McNaughton表示，该公司计划在未来两到三年内在全美国推广产品甚至销往国外。br//pp　　来自威斯康星大学的 Capio BioSciences公司也开发了一种类似的技术，名为CapioCyte。该技术整合了细胞滚动和多价结合功能。Capio BioSciences创始人Seungpyo Hong解释道，CapioCyte与其他CTC捕获技术不同之处在于，该技术结合了仿生学和纳米技术。癌症筛查和早期诊断是一个极大的市场，但Hong指出，每个患者的CTCs所呈现的高度变异数量和表型表明，CTCs的预后价值将在未来得到进一步探索。/pp　　除此之外，美国堪萨斯大学还在2018年5月公布了一项关于strong微流体平台的研究/strong，strong该平台可以对包括多发性骨髓瘤在内的克隆性浆细胞疾病患者的循环浆细胞进行检测/strong。在堪萨斯大学大学化学与机械工程专业教授Stephen Soper主导下，研究团队在2016年创建了Biofuidica公司，进一步开发一款使用正弦微流控技术的诊断工具。/pp style="text-align: center "strongspan style="color: rgb(192, 0, 0) "学术成果不断涌现/span/strong/pp style="text-indent: 2em "商业进程之外，关于CTC的学术成果在去年同样不断涌现。例如，来自加拿大英属哥伦比亚大学的研究人员便开发了一款strongCTC富集系统/strong。研究团队认为，通过结合生物物理富集和激光捕获显微切割(LCM)，该系统在一定程度上克服目前液体活检技的局限性。在本研究中，课题组通过溶解红细胞从前列腺癌血样中富集CTCs，使用一种特殊的微流体细胞分类方法分离白细胞和CTCs。为了提取单个CTC用于激光捕获显微切割，研究小组通过免固定染色选择肿瘤细胞，将细胞样本嵌入水凝胶基质中，使细胞固定。随后，研究小组然后使用一款短距离散焦UV激光提取包埋的细胞。br//pp　　此外，在去年4月份，来自加拿大多伦多大学的一个研究小组发布了一项关于strongmRNA细胞计数法的检测方法/strong，将CTC分离和基因表达分析结合起来。研究人员使用两种磁性颗粒，选择性杂交肿瘤细胞中mRNA的不同区域，帮助分离细胞并评估每个细胞中RNA的含量。研究小组利用免疫荧光法以及mRNA方法或EpCAM捕获法检测到CTCs。研究人员发现mRNA细胞计数方法能够同时提供CTC数量和临床相关mRNA的缺失或存在的准确情况。但研究小组表示，他们还将需要在CTCs含量较少的早期癌症患者中测试这种方法。/pp style="text-align: center "strongspan style="color: rgb(192, 0, 0) "结语/span/strong/pp style="text-indent: 2em "肿瘤液态活检的概念起源于CTC，相比ctDNA，发现较早却浮沉多年的CTC在几番打磨后逐渐发挥出自己的优势。借着二代测序技术的东风，ctDNA后来者居上占尽风头，但是CTC也完全没有落后。CTC分离和鉴定技术的发展使得相关研究再次成为肿瘤领域的焦点。如今，越来越多新的检测产品正在被使用，未来可能还会出现更多。随着更多数据的积累与临床证据的支持，液体活检的使用或将变得更加常规化。br//p

p　　早前，美国ProteinSimple公司推出全球第一款可以对循环肿瘤细胞、外泌体等微量样本进行蛋白质表达水平定量检测的Milo系统。一经推出，此产品立即获得《The Scientist》杂志年度创新产品第一名、生物通2016年度生命科学十大创新产品奖、中国仪器协会年度创新新产品奖等。它的发明人之一Kelly Gardner博士也获得MIT Technology Review 35岁以下创新人才奖。/pp style="text-align: center "img width="400" height="284" title="1.jpg" style="width: 400px height: 284px " src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/b89d84ca-1b3f-49c0-b5b1-82a689442e01.jpg" border="0" vspace="0" hspace="0"//pp　　通过检测血液中的循环肿瘤细胞(CTC)及循环肿瘤DNA发展起来的液体活检，对于肿瘤病人无痛诊断及靶向治疗有非常重要的意义。各国科学家在CTC富集、DNA测序和DNA分析方面做了很多的工作，但是CTC蛋白质研究一直因为检测灵敏度问题停滞不前，影响CTC在肿瘤诊断及治疗中发挥更重要的作用。/pp　　美国ProteinSimple Milo系统的推出解决了这一问题。最近，加州大学伯克利分校和斯坦福大学医学院的研究人员利用Milo系统在《Nature Communications》上发表文章，证实在一次普通的抽血后(2-4 ml血液)，可对血样中罕见的CTC进行蛋白质表达水平分析，以检测其中一组与癌症相关的蛋白质。/pp　　实验方案如下：科学家们从乳腺癌患者的血液中分离出循环肿瘤细胞，然后将循环肿瘤细胞接种到Milo芯片western blot细胞捕获孔中。微流体设备裂解细胞，让其内容物流出，之后进行电泳将蛋白质根据分子量大小进行分离。然后在凝胶中原位捕获蛋白，再进行抗体孵育杂交，最后通过荧光信号值进行定量，检测了癌症蛋白标志物的含量。/pp style="text-align: center "img title="2.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/1045381e-1f3a-40c1-a07f-82df916660d6.jpg"//pp style="text-align: center "(图片来自Nature Communications)/pp　　这项研究检测的蛋白靶标有12个，包括已被用于癌症分型(如ER、HER2、EGFR)、循环肿瘤细胞鉴定(如EpCAM、panCK、CK8)、白细胞标记(如CD45)的蛋白和普遍表达于哺乳动物细胞的蛋白(GAPDH、β-tubulin、mTOR、ERK-1/2、eIF4E)。研究者计划将这一名单继续扩大，以便最终能够更精确地对癌细胞进行分类，选择针对的靶向治疗药物。/pp style="text-align: center "img title="3.jpg" src="http://img1.17img.cn/17img/images/201709/insimg/60121d8a-3a5f-4b8b-9f0f-453af71e6bed.jpg"//pp style="text-align: center "(图片来自Nature Communications)/pp　　这篇文章的通讯作者、加州大学伯克利分校的Amy Herr表示：“微流体设计是本研究的关键。我们能够将每个阶段所需的功能整合在一起。这样，我们才能很快、很快地开展每一步。如果慢一点，细胞中的蛋白质将弥散，变得无法检测。”/p

肿瘤异质性对癌症预后和治疗反应有显著影响。传统的基因组和转录组分析被广泛用于研究不同的癌症类型，在预测预后和对不同治疗的反应以及为癌症治疗提供靶点方面具有潜在作用。不同癌症类型的单细胞分析表明，肿瘤免疫微环境的详细信息在多种癌症类型之间共享。目前，自从发现检查点抑制剂以来，免疫治疗彻底改变了癌症治疗并引起了越来越多的关注。肿瘤免疫微环境由非细胞成分(血管、细胞外基质、信号分子等)和细胞成分(T细胞、髓细胞、成纤维细胞等)组成。尽管传统的基因组和转录组学分析，也强调免疫相关途径和计算方法，并已应用于预测免疫细胞成分，但技术限制阻碍了时间的精确表征。传统的批量基因组和转录组分析获得的信号均来自不同细胞，掩盖了特定细胞类型和状态的识别。原位杂交和免疫组织化学已被用于探索单个细胞的基因组、转录组和蛋白质组学特征，但其产量相对较低。流式细胞术能够分析数千或数百万个单细胞蛋白质组学图谱；然而，这些方法需要事先选择感兴趣的抗体。随着细胞分离和测序技术的突破，单细胞转录组测序已经能够在单次运行中在单细胞水平上对许多细胞进行无偏好的全基因组分析。单细胞转录组测序已被用于分析单个细胞的转录组学，用于解析细胞间的异质性。肿瘤免疫微环境在诊断、治疗和预测不同类型癌症的预后方面显示出了潜力。与传统方法相比，scRNA-seq可用于识别新的细胞类型和相应的细胞状态，加深了我们对肿瘤免疫微环境的理解。1.介绍了scRNA-seq的原理，并比较了不同的测序方法。2.根据肿瘤免疫微环境中新的细胞类型、持续的过渡状态以及肿瘤免疫微环境成分之间的相互通讯网络找到了癌症的预后预测和治疗的潜在靶点。3.总结出在肿瘤免疫微环境中应用scRNA-seq后发现的由癌症相关成纤维细胞、T细胞、肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞组成的新型细胞簇。4.提出了肿瘤相关巨噬细胞和耗尽的T细胞的发生机制，以及中断这一过程的可能靶点。5.对肿瘤免疫微环境中细胞相互作用的干预治疗进行了总结。几十年来，肿瘤免疫微环境中的细胞成分定量分析已被应用于临床实践，预测患者生存率和治疗反应，并有望在癌症的精确治疗中发挥重要作用。总结目前的研究结果，我们认为单细胞技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以导致发现癌症治疗的新观点，并应用于临床。最后，作者提出了肿瘤免疫微环境研究领域的一些未来方向，并认为通过scRNA-seq对这些方向进行辅助。相关会议预告：8.30召开，点击报名scRNA-seq在刻画肿瘤免疫微环境中的应用scRNA-seq技术进展scRNA-seq程序主要包括单细胞的分离和提取、cDNA合成、核酸扩增、测序和数据分析。与传统的批量测序相比，scRNA-seq单个细胞中的RNA量相对较少。因此，需要更有效的扩增方法。研究人员已经成功建立了稳定的单细胞文库构建过程，以产生足够的cDNA用于测序。单细胞分离和捕获是scRNA-seq在不同方法中的基本程序。目前单细胞分离和捕获的常用方法。这些程序分为四大类：激光捕获微切割、油滴包裹技术、流式细胞荧光分选技术和微流控微孔技术。scRNA-seq技术的未来发展可能会降低成本并增加细胞产量，使scRNA-seq成为研究单个细胞转录组的标准工具。肿瘤免疫微环境的细胞成分肿瘤免疫微环境的细胞成分包括淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)、成纤维细胞和其他免疫细胞。成纤维细胞传统上被归类为基质细胞，因为它们在构建细胞外基质中发挥着重要作用。在这里，作者将肿瘤免疫微环境的癌相关成纤维细胞包括在内，因为它们分泌丰富的促炎和抗炎因子来重塑免疫微环境。细胞毒性CD8+T细胞识别肿瘤细胞上的特异性抗原并随后消除它们，是免疫微环境最常见和最有效的免疫细胞。CD8+T细胞的细胞毒性功能依赖于CD4+T Th1细胞。其他CD4+T细胞，包括Th2细胞和Th17细胞，也促进肿瘤微环境中的免疫反应。调节性T细胞抑制肿瘤免疫微环境并加剧肿瘤进展。自然杀伤T细胞和自然杀伤细胞也参与其中。它们的受体识别肿瘤细胞，从而激活其他免疫细胞。作为先天免疫的重要组成部分，骨髓细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞和树突状细胞，在肿瘤免疫微环境中发挥着重要作用。巨噬细胞通常分为促炎M1和抗炎M2表型。肿瘤相关巨噬细胞主要由M2巨噬细胞组成，通过产生生长因子和细胞因子促进肿瘤生长、肿瘤存活和血管生成。DC对于T细胞的抗原呈递至关重要，连接先天免疫和适应性免疫。癌症相关成纤维细胞在肿瘤免疫微环境中维持增殖和分泌调节因子，可分为炎症性CAF和肌纤维母细胞CAF。炎症性CAF具有较高的细胞因子和趋化因子分泌，而肌纤维母细胞CAF高度表达收缩蛋白，成纤维细胞对免疫微环境起相互抑制作用。研究表明，成纤维细胞募集M2巨噬细胞和调节性T细胞，抑制肿瘤微环境中的免疫反应。肿瘤相关成纤维细胞也被发现在某些情况下会支持抗肿瘤免疫。除了分泌抗体，B细胞还通过产生与T细胞相互作用的细胞因子参与细胞免疫。研究表明，B细胞抑制细胞毒性T细胞并诱导CD4+T细胞分化为调节性T细胞。B细胞也是最近引入的三级淋巴结构的重要组成部分，富含B细胞的三级淋巴结构与各种肿瘤的生存和免疫治疗反应有关。先前的研究强调了细胞成分在时间中的重要作用。然而，免疫细胞的鉴定常基于有限的细胞标记，并借助免疫组织化学。个体免疫细胞的转录组图谱是探索不同免疫细胞及其相应功能所必需的。为了理解细胞进化过程及其决定因素，有必要应用scRNA-seq观察每个细胞的转录动态。利用scRNA-seq探索免疫微环境的新发现聚类和注释对于解释scRNA-seq数据探索至关重要。根据细胞相似性对数据进行划分，挑战在于在不提供先验知识的情况下估计固有的簇数或密度。可能的解决方案是采用分层聚类方法来揭示细胞的分层结构，这也与细胞本体相一致。给定聚类方法产生的数据划分结果，需要细胞类型注释来提供生物学意义。注释的主要挑战是确定每个聚类中存在多少细胞类型，以及是否存在当前未发现的细胞类型。在实践中，研究人员通常首先识别每个聚类的标记基因，然后根据专业知识和文献对其进行注释。scRNA-seq使研究人员能够以更高的分辨率将免疫细胞分类为具有不同功能的亚群，描述了免疫细胞的常规亚型。利用scRNA-seq发现的淋巴细胞(T和NK细胞)、髓细胞(巨噬细胞和树突状细胞)和成纤维细胞的组成(图2)。人和小鼠样本的scRNA-seq表明，成纤维细胞可分为抗原呈递CAFs、癌症相关成纤维细胞或肌成纤维细胞。抗原提呈CAFs独特地表达主要组织相容性复合体(MHC)II类基因，包括激活CD4+T细胞的CD74。在结直肠癌中也观察到类似的抗原提呈CAFs亚群。乳腺癌症基因工程小鼠模型中成纤维细胞的scRNA-seq进一步鉴定了血管CAF、基质CAF、发育CAF和循环CAF。血管CAF、基质CAF和发育CAF似乎起源于固有成纤维细胞和恶性细胞发生上皮-间充质转化时的血管周围位置。循环CAF是血管CAF群体中增殖的部分。在其他小鼠模型中也发现了血管CAF和基质CAF，它们在患者乳腺肿瘤样本中是保守的，并且发现它们会增加乳腺癌症细胞的转移。提高CAF的分辨率为开发精确靶向CAF的药物提供了生物标志物。另一项关于乳腺癌症的scRNA-seq研究将调节性T细胞分为五类：共表达细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4的调节性T细胞、具有Ig和ITIM结构域的T细胞免疫受体，以及相互或仅表达相同基因的GITR和其他调节性T细胞，它们具有不同的功能。不同预后的患者具有不同比例的调节性T细胞簇，为个性化治疗提供了靶点。免疫微环境对T细胞和髓细胞进行了更详细的泛癌研究，发现存在颗粒酶K+T细胞、干扰素刺激基因+T细胞、杀伤细胞免疫球蛋白样受体在记忆性T细胞和NK细胞上表达、转录因子7+CD8+T细胞，ficolin 1+常规DC2、分泌性磷酸蛋白1+TAM，以及肿瘤微环境中的叶酸受体β+TAMs。基于scRNA-seq数据，免疫微环境还发现了新的免疫细胞亚群。葡萄膜黑色素瘤的scRNA-seq鉴定了以前未识别的细胞类型，包括主要表达检查点标记LAG3而不是程序性死亡-1或CTLA-4的CD8+T细胞。同时，在肝细胞癌中发现浸润耗尽的CD8+T细胞和具有高表达layilin的记忆T细胞的克隆富集，这些研究为癌症免疫治疗提供了新的靶点。因为CD8+T细胞是参与消除恶性细胞的主要成分。大肠癌CXC基序趋化因子的scRNA-seq鉴定配体BHLHE40+Th1样细胞与干扰素-γ调节转录因子BHLHE40。在不稳定肿瘤中，这些细胞对免疫检查点阻断有良好的反应，可能会提高免疫疗法的疗效。树突状细胞对于呈递抗原以激活肿瘤免疫微环境中的T细胞是必不可少的。胃癌的scRNA-seq揭示了一个新的树突状细胞簇，表达吲哚胺2,3-双加氧酶1和趋化因子C–C基序趋化因子配体(CCL)22、CCL17、CCL19和白细胞介素-32，它们参与T细胞的募集。胰腺导管腺癌的scRNA-seq还鉴定了除了常规细胞标记物之外还高表达吲哚胺2,3-双加氧酶1的树突状细胞簇。吲哚胺2,3-双加氧酶1对于催化色氨酸消耗和犬尿氨酸产生、抑制T细胞增殖和细胞毒性至关重要，这揭示了树突状细胞和T细胞之间的密切相互作用。此外，通过scRNA-seq鉴定了溶酶体相关膜蛋白3+树突状细胞，并且似乎是经典树突状细胞族的成熟形式。溶酶体相关膜蛋白3+DC可以迁移到淋巴结，并高度表达与T细胞相互作用的配体。这些表达特异性标记物的新型树突状细胞簇的发现为癌症免疫治疗提供了一个新的视角。使用scRNA-seq在肺腺癌中发现了肿瘤相关巨噬细胞的新特征基因，包括髓系细胞触发受体2、CD81、具有胶原结构的巨噬细胞受体和载脂蛋白E。此外，乳腺癌症的scRNA-seq表明，除了M2型基因如CD163、跨膜4域A6A和转化生长因子β1外，血管生成因子纤溶酶原激活剂、尿激酶受体和IL-8也在肿瘤相关巨噬细胞中表达。肿瘤相关巨噬细胞中这些新的基因特征图谱与患者生存相关，并为癌症治疗提供了新的潜在靶点。肿瘤样本scRNA-seq显示，一个肿瘤相关巨噬细胞亚群呈现出SPP1、巨噬细胞清除剂受体MARCO和MHC II类基因的高表达。MARCO和SPP1是巨噬细胞激活中的抗炎和免疫抑制信号，而MHC II类基因与促炎功能有关。其他scRNA-seq研究表明，肿瘤相关巨噬细胞经常同时具有促炎和抗炎特征。这一现象表明，肿瘤微环境中的巨噬细胞活化与传统的M1/M2极化不一致。图2：利用scRNA-seq揭示免疫微环境中的新的免疫亚群单细胞数据揭示免疫细胞进化大多数免疫细胞都处于细胞发育过程中。大量的免疫细胞处于发育轨迹的瞬态状态，而不是分化良好的细胞的离散状态。借助scRNA-seq和深入分析，研究人员可以探索分化细胞的特征、特定细胞类型的转变及其可能的机制。最常用的计算方法是拟时序分析。轨迹描述了细胞的发育过程，其特征是基因表达的级联变化。分支点代表细胞分化的显著差异。各种机器学习计算方法已被用于构建轨迹，包括Monocle3、DTFLOW、DPT、SCORPIUS和TSCAN，这些方法已在单独的综述中进行了评估和比较。由于肿瘤相关巨噬细胞和T细胞代表了免疫微环境中最丰富的免疫细胞类型，这里主要关注这两种细胞类型。scRNA-seq显示，TAMs经常共表达M1基因，包括TNF-α和M2基因，如IL-10，并且肿瘤相关巨噬细胞的分化和状态与其抗肿瘤作用直接相关。拟时序轨迹分析证实，肿瘤相关巨噬细胞在M1和M2表型之间连续转换。转录因子IRF2、IRF7、IRF9、STAT2和IRF8似乎在决定TAMs分化中很重要，并可作为表观遗传学靶点诱导肿瘤相关巨噬细胞的M1极化，从而产生促炎和抗肿瘤的微环境。使用环境刺激和抗原T细胞受体(TCR)刺激测定T细胞表型。不同状态的细胞之间TCR库的重叠，即TCR共享，也可用于研究T细胞的进化。结合scRNA-seq和TCR追踪在结直肠癌中发现20个具有不同功能的T细胞亚群。在黑色素瘤肿瘤的耗竭T细胞中发现了28个基因的耗竭特征，包括TIGIT、TNFRSF9/4-1BB和CD27，并且在大多数肿瘤的高耗竭细胞中也被发现上调。另一项关于T细胞的研究进一步鉴定了CD8+T细胞中的其他耗竭标记物，如LAYN、普列可底物蛋白同源物样结构域家族A成员1和突触体相关蛋白47。拟时序轨迹分析表明，T细胞在时间上处于连续激活和终末分化(衰竭)状态(图3)。已经进行了额外的研究来研究耗尽的T细胞的进化和逆转T细胞耗尽的潜在靶点。scRNA-seq与TCR分析相结合表明，功能失调的衰竭T细胞和细胞毒性T细胞可能在时间上与发育有关。因此，研究集中在CD8+T细胞从效应细胞到衰竭T细胞的过渡过程。scRNA-seq鉴定出两个CD8+T细胞簇为非小细胞肺癌中预先耗尽的T细胞。在肺腺癌中，预先耗尽与耗尽的T细胞比率与更好的预后相关。因此，在耗尽前中断预先耗尽的T细胞可能对癌症免疫治疗至关重要。由于免疫细胞和恶性细胞之间的密切相互作用，恶性细胞的进化在免疫细胞进化中也起着至关重要的作用。拟时序轨迹分析表明，转移性肺腺癌的轨迹分支不同于向纤毛细胞和肺泡型细胞的正常分化。受恶性细胞进化的影响，正常的骨髓细胞群体被单核细胞衍生的巨噬细胞和新型树突状细胞取代。T细胞也被发现会衰竭，从而构建免疫抑制的肿瘤微环境。同样，另一项研究表明甲状腺癌症细胞来源于乳头状甲状腺癌症细胞亚簇，其中构建了不同的肿瘤免疫微环境，导致预后显著恶化。图3：肿瘤相关T细胞和巨噬细胞的进化过程免疫微环境中不同细胞间的通讯网络免疫微环境上的细胞通讯与肿瘤进展有关。配体-受体相互作用是一种重要的细胞通讯类型，对于构建免疫微环境和识别潜在的治疗靶点至关重要。scRNA-seq是在细胞基础上进行的，这使得研究未发现的细胞相互作用变得可行。已经开发了许多基于scRNA-seq数据研究配体-受体相互作用的分析工具，包括iTALK、CellTalker和CellPhoneDB。这些工具利用了已知配体-受体对相互作用的数据库。其中，CellTalker利用差异表达的基因，而CellPhoneDB包括配体和受体的亚基结构。其他工具，如NicheNet，也考虑了受体细胞下游通路的变化。在肿瘤进展过程中，恶性细胞导致免疫细胞的募集和功能障碍，从而相互影响肿瘤的发生和恶性细胞的进化，形成恶性循环(图4)。发现TAMs通过表皮生长因子受体-双调节蛋白配体受体对与恶性细胞相互作用。在基底样乳腺癌细胞系中AREG的调节导致抗炎TAMs的招募。同时，基于scRNA-seq，发现了一种EGFR相关的反馈回路可促进胰腺腺鳞癌的进展。来源于TAMs的抑瘤素M也与其在恶性细胞上的受体相互作用，以激活信号转导子和转录激活子3。研究人员通过整合素受体与胶原蛋白、纤维连接蛋白、血小板反应蛋白1配体和富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体4-R-反应蛋白3的相互作用，发现CAF与胃癌细胞之间的通信，这些配体调节干细胞。此外，胰腺导管腺癌的scRNA-seq揭示了TIGIT与T细胞和NK细胞中的甲型肝炎病毒细胞受体2之间的相互作用，以及它们在恶性细胞中的相应配体PVR和LGALS9，导致免疫细胞功能障碍和胰腺癌症进展。因此，基于单细胞数据探索免疫细胞和恶性细胞之间的细胞相互作用提供了可能治疗靶点，以打破肿瘤进展的恶性循环。除了恶性细胞外，scRNA-seq和随后的分析还预测了免疫细胞之间在时间上的相互作用，这表现出相反的功能(图3)。例如，研究发现TAM降低了CXCL12-C-X-C基序趋化因子受体3和CXCL12-CXCR4的相互作用，增强了鼻咽癌细胞毒性T细胞和Tregs之间的CD86-CTLA-4相互作用，导致肿瘤免疫微环境加重癌症进展。此外，CAFs通过分泌CXCL12募集Tregs，并通过periostin与M2巨噬细胞相关。图4：免疫微环境中的细胞通讯网络基于scRNA-seq的肿瘤免疫微环境的临床应用和潜在靶点几十年来，临床实践中一直采用时间的量化来预测患者的生存率和对治疗的反应。利用免疫组化分析的免疫评分，量化肿瘤中的原位免疫细胞浸润。与传统的免疫评分相比，scRNA-seq在免疫微环境上提供了前所未有的渗透免疫细胞分辨率。已经鉴定出与预后相关的新的免疫细胞簇。例如，在早期复发的肝细胞癌中发现了一种独特的低细胞毒性先天性样CD8+T细胞表型。这些T细胞过表达KLRB1，同时下调共刺激和耗竭相关分子，包括肿瘤坏死因子受体超家族、成员9、CD28、诱导型T细胞共刺激因子、TIGIT、CTLA-4和HAVCR2。这种T细胞簇的浸润与癌症的不良预后相关。此外，基于scRNA-seq的细胞相互作用也被计算在预测模型中。基于细胞间通讯相关基因构建了机器学习模型，以预测肺腺癌的复发。将八个细胞间通讯相关基因和患者的临床信息相结合，获得了0.841的受试者-操作者特征曲线下面积。除了预后预测外，肿瘤免疫微环境中独特的细胞相互作用也与免疫疗法的反应有关。scRNA-seq分析发现，抗PD-1治疗的应答者和非应答者之间存在不同的细胞-细胞通信网络，有可能预测患者对抗PD-1疗法的反应。因此，在scRNA-seq的帮助下，可以更准确地预测患者的预后和对免疫疗法的反应。利用scRNA-seq在精准医学中具有启发性，例如帮助靶向治疗克服耐药性。例如，医生在使用替比法尼治疗的非CR肌肉浸润性膀胱癌症患者治疗前后应用患者衍生异种移植物的scRNA-seq。在治疗后的PDX中发现PD-L1的上调，并降低了免疫细胞的抗肿瘤作用。因此，选择了用PD-L1抑制剂进行额外治疗。随后，患者获得了良好的反应。此外，在单药耐药性肿瘤中，通过scRNA-seq鉴定了新的免疫亚型。用抗集落刺激因子1受体阻断TAMs不能减少胆管癌的肿瘤进展。scRNAs-eq鉴定了表达APOE的粒细胞髓系衍生抑制细胞的补偿富集，其介导T细胞抑制。TAMs和粒细胞性骨髓源性抑制细胞的双重抑制与抗CSF1R和抗淋巴细胞抗原6复合物、基因座G治疗联合增强了小鼠的免疫检查点阻断效果小鼠模型，这在临床实践中很有前景。除了治疗耐药肿瘤外，scRNA-seq在免疫微环境上的应用也突出了需要进一步研究的潜在新靶点。T细胞是免疫微环境中去除恶性细胞最重要的免疫细胞。然而，在不同的肿瘤中，耗尽的CD8+T细胞会导致不利的预后。除了众所周知的免疫抑制检查点外，scRNA-seq还鉴定了高表达内皮前体蛋白、酪氨酸酶相关蛋白1和内皮素受体B型的耗尽CD8+T细胞，这些细胞可以作为新的潜在靶点。髓细胞是免疫微环境招募免疫细胞所必需的。通过scRNA-seq鉴定TREM2/APOE/补体组分1，q亚组分阳性巨噬细胞浸润为透明细胞肾癌复发的预后生物标志物。另一项研究证实，小鼠中靶向TREM2的抗体与缺乏MRC1+和CX3CR1+巨噬细胞以及表达免疫刺激分子的髓系簇的扩增有关，这促进了T细胞反应并导致更好的预后。细胞相互作用也可以用作治疗靶点。肝内胆管癌的scRNA-seq揭示了血管CAFs与肝内胆管细胞之间的串扰。血管CAFs分泌的IL-6诱导Cajal间质细胞细胞的表观遗传学改变，从而增强恶性肿瘤。因此，IL-6信号在Cajal间质细胞的中断变得非常有趣。表1总结了scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点。表1：scRNA-seq显示的癌症治疗的潜在靶点总结scRNA-seq可以绘制全面的肿瘤免疫微环境细胞图谱，为各种肿瘤的临床应用提供了新的视角。此外，免疫微环境的细胞成分和通讯为癌症治疗提供了潜在靶点，并有助于精确医学的发展。技术的进步和单细胞分析的广泛应用可以发现癌症治疗的新观点，助力临床研究。作为突破性的新技术，单细胞分析技术有望逐渐取代传统的整体样本二代测序。单细胞分析技术在临床和药物开发方面的应用前景更为广阔，可以代替或补充分子、细胞和组织病理检测的现有技术，也可以用于新兴的细胞治疗。