细菌焚化炉

抗生素抗性的频繁出现对现代医学提出挑战。探讨抗性的进化过程对遏制其全球传播至关重要。抗性进化过程涉及高度复杂的表型异质性响应。在抗生素处理下，基因完全相同的微生物菌群中会出现小部分可耐受抗生素的细胞亚群。该存活的亚群在抗生素存在时不能生长，但在去除抗生素后可恢复生长，造成长期复发性感染，也是后续发生抗性基因突变的关键储库。然而，由于耐受亚群的复杂异质性响应且生长停滞，从大量细菌群体中识别耐受亚群并追踪其生理进化轨迹仍是挑战。 近日，中国科学院城市环境研究所朱永官院士团队与崔丽研究组在《德国应用化学》上，发表了题为An Isotope-Labeled Single-Cell Raman Spectroscopy Approach for Tracking the Physiological Evolution Trajectory of Bacteria toward Antibiotic Resistance的研究论文。该研究通过发展单细胞拉曼-氘标同位素-多元统计分析等多种技术联用的方法，在单细胞的高精度水平原位解析了细菌响应的异质性，并从大量细菌群体中灵敏识别出表型亚群的分化及动态变化，实现了抗性突变前细菌表型生理轨迹的快速原位追踪，为遏制抗性进化提供重要指导。 该研究将细菌多次循环暴露于临床治疗剂量的抗生素，进化出抗生素抗性。研究利用重水标记的单细胞拉曼光谱以不依赖培养的方式，检测进化过程中细菌的原位活性。结果发现，在未发生抗性突变的情况下，细菌在抗生素压力下的活性随处理循环逐渐增加，说明其表型耐受性逐渐提高。进一步，研究利用UMAP多元统计算法对所有进化阶段的上千个细菌的单细胞拉曼指纹区间进行分析。根据拉曼指纹指示的细菌表型生理响应，从初始基因型完全相同的细菌群体中，研究识别出随抗性进化发生分化的四个表型亚群，即敏感菌群、原生耐受菌、进化耐受菌和进化抗性菌，并灵敏捕捉到四个亚群随进化过程的动态变化。至此，基于单细胞拉曼所揭示的细菌原位表型异质性响应，科研人员绘制出抗性进化的生理轨迹图。细菌全基因组测序对所揭示的表型进行交互验证，并解析了表型产生的遗传基础。表型分化对维持整个菌群的生存和进化至关重要。由于表型分化远早于抗性突变，识别表型分化对指导临床用药以及减少抗生素耐受性和抗性突变的发生具有重要意义。研究利用明显区分的四个亚群的拉曼图谱，挖掘出耐受性和抗性突变的拉曼标记峰，促进了抗性进化不同阶段尤其是表型耐受性的快速精准识别。 该单细胞分析平台可以拓展到更广泛的抗生素或非抗生素化学品诱导的抗性进化研究。未来可以将该单细胞拉曼与靶向单细胞分选和多组学技术联用，实现耐受性和抗性表型与基因型的精确关联，促进进一步阐释进化机制。研究工作得到中科院“从0到1”原始创新项目、国家自然科学基金创新研究群体项目、福建省自然科学基金等的支持。 单细胞拉曼-同位素标记-多元统计分析追踪细菌抗生素抗性进化的轨迹

p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 细菌已经进化出生活在地球上的适应性。但与可以保存为化石的植物和动物不同，细菌几乎没有遗传进化的物理证据，这使得科学家很难准确确定不同细菌群体的进化时间。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 麻省理工学院的科学家们已经设计出一种可靠的方法来确定某些细菌群何时出现在进化历史中。该技术可用于识别细菌进化过程中何时发生重大变化，并揭示导致这些变化的原始环境的细节。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 1月28日在BMC进化生物学杂志上的一篇论文提到，研究人员报告使用该技术确定了，在古生代时期，大约3.5亿至4.5亿年前，几种主要的土壤细菌群从真菌中获得了一种特定的基因。这使得它们能够分解几丁质，并利用其产品生长。几丁质是一种在真菌的细胞壁和节肢动物的外骨骼中发现的纤维物质。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 这种细菌的进化适应可能是由环境的重大转变所驱动的。大约在同一时间，早期蜘蛛，昆虫和蜈蚣等节肢动物正从海洋移动到陆地上。随着这些陆生节肢动物的传播和多样化，它们留下几丁质，创造了更加丰富的土壤环境，并为细菌提供了新的机会，特别是那些获得几丁质酶基因的细菌。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 麻省理工学院地球，大气和行星科学系的Cecil和IdaGreen地球生物学助理教授GregoryFournier说：“在此之前，地球上应该有土壤，但它可能看起来像南极洲的干燥山谷。动物生活在土壤中之后，为微生物提供了利用优势和多样化的新机会。” /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " Fournier说，通过追踪细菌中的几丁质酶等某些基因，科学家们可以对动物的早期历史及其生活环境有所了解。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " “微生物在他们的基因组中包含动物生命的未知历史，我们可以用它来填补我们不仅对微生物，乃至对动物早期历史认知的空白，”Fournier说。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 该论文的作者包括主要作者DanielleGruen博士，现在是美国国立卫生研究院的博士后，以及前博士后JoannaWolfe，现在是哈佛大学的研究科学家。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 缺少化石 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 在没有化石记录的情况下，科学家们利用其他技术来研究细菌的“生命之树”，遗传关系图，显示出许多分支和分裂，因为细菌随着时间的推移已经演变成数十万种。科学家通过分析和比较现有细菌的基因序列建立了这个遗传关系图。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 使用“分子钟”方法，他们可以估计某些基因突变可能发生的速率，并计算两个物种可能发生分化的时间。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " “但这只能告诉你相对时间，因为这些估计值存在很大的不确定性，”Fournier说。“我们必须以某种方式将这棵树锚定在地质记录上，是绝对时间。” /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 该团队发现他们可以使用来自完全不同的生物体的化石来锚定某些细菌群进化的时间。虽然在绝大多数情况下，基因通过世代传承，从父母到后代。但每隔一段时间，一个基因就可以通过病毒或通过环境从一个生物体跳到另一个生物体，这个过程称为水平基因转移。因此，相同的基因序列可以出现在两种生物中，否则它们将具有完全不同的遗传历史。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " Fournier和他的同事推断，如果他们能够识别细菌和完全不同的生物之间的共同基因，比如一个具有明确化石记录的生物，他们可能能够将细菌的进化固定到这个基因从化石的有机体转移到细菌的时间。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 分裂的树木 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 他们查看了数千种生物的基因组序列，并鉴定了一种基因，几丁质酶，它出现在几个主要细菌群体以及大多数真菌种类中，这些真菌具有完善的化石记录。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 紧接着，他们利用几丁质酶基因产生所有不同物种的遗传关系图，推算出显示基于该基因组突变的物种之间的关系。接下来，他们采用分子钟方法确定每种含有几丁质酶的细菌从其各自祖先分支的相对时间。他们对真菌重复了同样的过程。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 研究人员将真菌中的几丁质酶追踪到它最初出现在细菌中时与该基因最相似的点，并推断当真菌将基因转移到细菌时就会如此。然后，他们使用真菌的化石记录来确定转移可能发生的时间。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 他们发现，真菌将该基因转移到几组细菌中，含有几丁质酶基因的三大类土壤细菌在34.5亿至4.5亿年前就已经多样化了。微生物多样性的快速爆发可能是对陆地动物的类似多样化的反应，特别是产生几丁质的节肢动物。这种情况发生的时期，也正如化石记录显示的那样。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " “这个结果支持上面提出的想法，一旦进入新的环境微生物群体就会尽快获得能在该环境下的基因，”Fournier指出。“原则上，这种方法可以用于更多的微生物群体，转移其他物种使用其他资源的基因。” /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " Fournier现在正在开发一种自动化管道，用于从大量基因数据中检测细菌和其他生物之间有用的基因转移。例如，他正在研究负责分解胶原蛋白的微生物基因，胶原蛋白是一种仅在动物身上产生的化合物，存在于柔软的身体组织中。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " “如果我们找到微生物中摄取软体组织的群体，那么我们就可以重建软体组织早期的未知历史，这在化石记录中所缺失的一部分，”Fournier说。 /p p style=" text-indent: 2em text-align: justify " 这项研究部分得到了美国国家科学基金会和西蒙斯基金会的支持。 /p p br style=" text-indent: 2em text-align: left " / /p

背景近年来，多重耐药性 (multi-drug resistance, MDR) 的出现已成为多国关注的公共卫生问题，作为细菌变异及过度使用抗菌药物的结果，它的主要机制是外排膜泵基因突变，其次是外膜渗透性的改变和产生超广谱酶。最常见的耐药菌为革兰阳性菌MDR-TB和MDR-MRSA，以及在ICU中常出现的鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌。统计数据显示，血液感染细菌铜绿假单胞菌与30%至50%的高死亡率有关。正因为如此，迫切需要开发新的抗菌药来对抗感染。数字PCR 技术作为一项高灵敏性、高精确性、绝对定量技术，可有效助力病原微生物耐药性分析及新药研发等应用。QIAGEN的QIAcuity数字PCR系统基于纳米微孔板技术，采用集成式一体化设计理念，支持多通道检测，可实现高通量、高灵敏性检测。接下来小编带您一起解读QIAcuity数字PCR系统在该研究领域的实际应用案例。本案例中，来自英国朴茨茅斯大学、泰国纳瑞宣大学和披博宋甘皇家大学的研究人员基于QIAGEN QIAcuity dPCR平台，建立了多重反转录数字PCR (mRT-dPCR)，深入研究了氢奎宁（抗疟疾药物）的天然化合物对临床常见微生物的抗感染机制。方法与结果研究者首先在前期细菌实验中发现氢奎宁可以抑制和杀死几种临床重要细菌，即金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌以及常见的多重耐药病原体铜绿假单胞菌。通过进一步研究，作者发现氢奎宁对铜绿假单胞菌的杀菌浓度是其他菌株的2-4倍，且在4-8h内对铜绿假单胞菌不仅有抑菌杀菌作用，还存在呈剂量依赖性。为了进一步验证氢奎宁对多重耐药病原体铜绿假单胞菌的抗菌和耐药机理，即氢奎宁是否能够在铜绿假单胞菌中诱导其主要的外排泵类型，即耐药节结化细胞分化家族 (RND) 相关基因的异常表达。作者利用QIAcuity dPCR系统，建立了多重数字PCR (mdPCR) 和多重反转录数字PCR (mRT-dPCR) 两套研究路线，成功用于快速检测多种临床相关细菌中是否存在mexB、mexD和mexY这三种关键基因，并对其表达量的变化也进行了进一步的分析。结果表明，在0.5X MIC氢奎宁作用1h后，mexD和mexY的表达量分别提高了20.8±4.31和11.8±5.01倍，而相比之下mexB的表达水平则相对稳定（1.6±0.15倍）。这些数据表明，在P. aeruginosa ATCC27853菌株中，虽然氢奎宁诱导了MexCD-OprJ和MexXY外排膜泵的上调，但MexAB-OprM外排膜泵则并没有上调，意味着铜绿假单胞菌是通过上调MexCD-OprJ和MexXY外排膜泵的水平而诱导了一种保护机制来避免氢奎宁引起的细胞应激，进而产生一定程度的耐药性。结论研究者基于QIAcuity dPCR系统建立的多重反转录数字PCR (mRT-dPCR) 技术路线，阐明了低剂量的氢奎宁可诱导铜绿假单胞菌特异性RND型外排膜泵基因表达水平变化，进而引起了一定程度的耐药性。研究者也表示将进一步研究氢奎宁的抗菌活性和副作用，揭示氢奎宁的分子靶标，从而对氢奎宁在临床中的使用提供更多指导。 参考文献：Hydroquinine Possesses Antibacterial Activity, and at Half the MIC, Induces the Overexpression of RND-Type Efflux Pumps Using Multiplex Digital PCR in Pseudomonas aeruginosa. Nontaporn Rattanachak, Sattaporn Weawsiangsang, Touchkanin Jongjitvimol, Robert A Baldock and Jirapas Jongjitwimol 1,4,5,END