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1、搅拌式动物细胞培养罐 搅拌式培养罐靠搅拌桨提供液相搅拌的动力,它有较大的操作范围、良好的混合性和浓度均匀性,因此在生物反应中被广泛使用。但由于动物细胞没有细胞壁的保护,因此对剪切作用十分敏感,直接的机械搅拌很容易对其造成损害,传统的用于微生物的搅拌培养罐用作动物细胞的培养显然是不合适的。所以,动物细胞培养中的搅拌式培养罐都是经过改进的,包括改进供氧方式、搅拌桨的形式及在培养罐内加装辅件等。 (1)供氧方式的改进 一般情况下搅拌式培养罐还常伴有鼓泡,为细胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪胞生长提供所需氧分。由于动物细胞对鼓泡的剪切也很敏感,所以人们在供氧方式的改进上做了许多工作。笼式供氧是搅拌式动物细胞培养罐供氧方式的一种,即气泡用丝网隔开,不与细胞直接接触。培养罐既能保证混合效果又有尽可能小的剪切力,以满足细胞生长的要求。北野昭一报道了一个经过改进的搅拌式动物细胞培养罐,整体呈梨形,搅拌置于培养罐底部,在搅拌轴外装了一个锥形不锈钢丝网与搅拌轴一起转动。轴心处的鼓泡管在丝网内侧鼓泡,丝网外侧的细胞不与气泡直接接触。 (2)搅拌桨的改进 搅拌桨的形式对细胞生长的影响非常大,这方面的改进主要考虑如何减小细胞所受的剪切力。有人对搅拌桨的形式作了改进,并在反应器内加装了辅件,实验证明改进后的反应器适用于对剪切力敏感的细胞进行高密度培养。反应器采用了一个双螺旋带状搅拌桨,顶部的法兰盖上安装了3块表面挡板。每块挡板相对于径向的夹角为30°,垂直插入液面。挡板的存在减小了液面上的旋涡。这个反应器维持了较小的剪切力,实验中用于昆虫细胞的培养,最终的培养密度达到6×106个/mL,成活率在98%以上。 2、非搅拌式动物细胞培养罐 搅拌式细胞培养罐用于动物细胞培养存在的最大缺点是剪切力大,容易损伤细胞,虽然经过各种改进,这个问题仍很难避免。相比之下,非搅拌式培养罐产生的剪切力较小,在动物细胞培养中表现出了较强的优势。 (1)填充床反应器填充是在反应器中填充一定材质的填充物,供细胞贴壁生长。营养液通过循环灌流的方式提供,并可在循环过程中不断补充。细胞生长所需的氧分也可以在反应器外通过循环的营养液携带,因而不会有气泡伤及细胞。这类反应器剪切力小,适合细胞高密度生长。 (2)中空纤维反应器中空纤维培养罐由于剪切力小而广泛用于动物细胞的培养。这类培养罐由中空纤维管组成,每根中空纤维管的内径约为200μm,壁厚为50~70μm。管壁是多孔膜,O2和CO2等小分子可以自由透过膜扩散,动物细胞贴附在中空纤维管外壁生长,可以很方便地获取氧分。 (3)气升式细胞培养罐气升式生物反应器(airliftbioreactor)也是实现动物细胞高密度培养的常用设备之一,其特点是结构简单,操作方便。有人在气升式反应器中利用微载体培养技术,研究了Vero细胞高密度培养的工艺条件。证明气升式反应器中悬浮微载体培养Vero细胞,在加入适量保护剂、营养供应充足的情况下,细胞可以正常生长至长满微载体表面,终密度可达1.13×106个/mL。
张韧,王建超,陈文庆,刘华杰,高飞,徐舸辰,林龙飞(北京清大天一科技有限公司,北京102200) 反应器悬浮培养技术是目前国内外疫苗生产的热点之一,它可以极大提高疫苗的质量和生产率。介绍了该技术在国内外疫苗生产中的研发和应用现状,表明国内该技术目前已经在口蹄疫疫苗生产中获得成功应用,利用MDCK、Vero等细胞培养生产禽流感疫苗的技术也正在积极研发中,并将逐步替代传统的鸡胚生产工艺。积极推广和应用这一新型疫苗生产技术将是我国兽用生物制品行业升级换代的必然趋势。 生物反应器;悬浮培养;微载体培养;口蹄疫;禽流感 在我国,细胞反应器悬浮培养和微载体培养技术在动物疫苗生产领域的研发和应用正成为行业技术革新、产业升级的重要内容。农业部公告第1708号中明确规定,自2012年2月1日起,各省级兽医行政管理部门停止转瓶培养生产方式的兽用细胞苗生产线项目兽药GMP验收申请。该公告对动物疫苗生产技术升级做出了强制性规定。本文就反应器细胞悬浮培养和微载体培养技术在口蹄疫疫苗和禽流感疫苗生产中的国内外应用和发展进行了综述,分析了动物疫苗产业发展趋势和我国疫苗产业技术升级所面临的机遇和挑战。1 反应器悬浮培养技术在口蹄疫疫苗生产中的应用口蹄疫被认为家畜传染性疾病中传染性最强的一种疾病,国际兽医局(OIE)将之列为A类传染病。2010和2011年,在亚洲、非洲都有口蹄疫局部的爆发。接种安全、高效的疫苗是预防口蹄疫疫情发生的最有效策略之一。通常主要通过浓缩技术提高口蹄疫疫苗的有效抗原量来实现其高效性;通过病毒纯化工艺、有效的病毒灭活工艺来保证疫苗的安全性。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒能显著提高口蹄疫病毒抗原浓度。国际上先进的口蹄疫疫苗的生产工艺都采用反应器悬浮培养BHK21细胞技术、有效的病毒纯化工艺及二次病毒灭活工艺。当前,面对国内外严峻的口蹄疫防控形势,高质量的口蹄疫疫苗必将在口蹄疫防控中发挥关键作用。1.1 国外应用现状和发展趋势 BHK21细胞是繁殖口蹄疫病毒的理想宿主。20世纪60年代,许多国家实验室建立起了转瓶培养BHK21细胞繁殖口蹄疫病毒的生产系统。1962年BHK21细胞悬浮培养成功,细胞增殖迅速,并成功应用于口蹄疫病毒的生产。反应器悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒也就成为最普遍的口蹄疫疫苗生产方式,主要集中在印度、土耳其、巴西、阿根廷等国家(表1)。印度口蹄疫生产企业使用8000L反应器生产口蹄疫疫苗,南美口蹄疫疫苗生产企业一般采用3000~5000 L反应器生产口蹄疫疫苗,口蹄疫病毒抗原146S浓度大约在2 μg/mL。因为口蹄疫疫苗保护力与146S有正相关性,这些企业根据口蹄疫病毒146S来配制疫苗有效地保证了疫苗的质量。表1 国外部分悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫疫苗企业及其生产工艺http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1375859824_small.jpg*来自作者所属公司的客户信息调查但是,这种20世纪60年代开发的口蹄疫疫苗生产工艺延续至今,存在许多技术上的缺陷。国外口蹄疫疫苗生产使用的BHK21细胞培养液是添加磷酸肉汤(Tryptosephosphate broth, TPB)或水解乳蛋白(Lactalbumin hydrolysate, LAH)的GMEM及EMEM,再补加5%~10%牛血清(表1)。不同批次间血清质量差异引起细胞培养效果不稳定,导致影响疫苗生产工艺的稳定性和疫苗质量。疫苗中残留的血清蛋白使接种动物过敏反应升高,一定程度上影响疫苗的安全性。在口蹄疫强制免疫的国家,牛血清中存在含有抗口蹄疫病毒抗体的可能性,不仅影响病毒繁殖,而且可能导致口蹄疫病毒在抗体压力下选择性变异。牛血清中潜在污染朊病毒或疯牛病病毒可给动物疫苗带来潜在的生物危害,TPB或LAH等动物来源成份也存在安全隐患。为提升产品质量及安全性,目前国外多数口蹄疫疫苗生产厂家急于将现使用的含血清生产工艺升级为不含血清生产工艺。自从20世纪的80年代起,细胞培养基(液)发展迅速,低血清细胞培养基、无血清细胞培养基、无血清无动物来源成分细胞培养基已商品化,为疫苗生产中少使用或不使用血清奠定了物质基础。1.2 国内应用现状 默克密理博北京清大天一科技有限公司(以下简称“清大天一”)在国内较早开发了BHK21低血清细胞培养基和BHK21无血清无动物来源成分细胞培养基。2008年,清大天一开发了BHK21低血清细胞培养基及反应器悬浮培养BHK21技术,并于2009年成功应用到国内一家口蹄疫疫苗生产企业中。使用该工艺生产的口蹄疫抗原146S浓度可以达到3 μg/mL左右,工艺全过程管道化操作,产品内毒素含量低,口蹄疫疫苗生产和质量显著提高,同时生产成本下降30%。2009年,清大天一成功开发了BHK21无血清无动物来源成分培养基和反应器无血清悬浮培养BHK21细胞技术,并 2010年成功应用到国内某口蹄疫生产企业。相比于含血清悬浮培养工艺,无血清悬浮培养工艺具有巨大的技术优势。从种子库复苏BHK21细胞开始,到口蹄疫病毒繁殖、直至收获的全过程,不添加任何的血清和动物来源成分,消除了血清抗体对病毒繁殖的干扰,同时减轻了纯化压力。无血清悬浮培养BHK21细胞的细胞密度可以达到5×106~6×106/mL以上,为生产高浓度口蹄疫疫苗奠定了技术基础。图1是反应器无血清培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒的工艺流程图,相比于含血清口蹄疫病毒生产工艺,因实现细胞无血清培养,工艺过程无需沉降换液。 http://img.dxycdn.com/trademd/upload/userfiles/image/2013/08/A1375859832_small.jpg 图1 4000L反应器无血清悬浮培养BHK21细胞生产口蹄疫病毒工艺流程目前国内某企业使用该工艺生产的口蹄疫疫苗正处于报批阶段,其他多家口蹄疫疫苗生产企业及研究单位也在研发或寻求无血清悬浮培养生产口蹄疫疫苗的工艺。
分享一个手册,既有原理也有具体操作![img]http://www.instrument.com.cn/bbs/images/affix.gif[/img][url=http://www.instrument.com.cn/bbs/download.asp?ID=122083]实用哺乳动物细胞培养手册[/url]实用哺乳动物细胞培养手册细胞培养基本概念细胞培养目的与用途细胞培养基本条件细胞培养基种类与基本成分细胞培养环境细胞培养无菌操作基本技术培养细胞生长过程:潜伏期→指数增生期→停滞期培养细胞基本形态细胞培养所用玻璃及塑料制品的清洗与消毒细胞培养常用物品哺乳动物细胞冷冻保存