安诺优达测序仪

以下问题是我摘抄的，当时记在我的记录本上，所以没有记下名字，很是抱歉。但是我想拿出来这是对大家的一种共享，所以祈求大家原谅。Q:我将PCR产物纯化后送测，结果说是双模板，测序峰重叠，请问是模板不纯吗？A:应该指的是模板不纯。可能是割胶纯化时，范围偏大，非目的基因片断亦混入其中。该非目的片断的大小与目的片断也类似。如果片断长度大的话，可以先连一下克隆载体，这样测序应该没有问题。 测序峰重叠不知道你讲的时双峰类型的还是指比较杂乱的而且无序的重叠： 如果是双峰（TP）,有可能是标本来源是杂合子的缘故，如果是后者，原因很多，一般看打印出的测许结果大致可以判断。原因：1。有时候PCR产物可能就是失败的产物或者浓度很低。2．提纯不好，非目的片段保留。3．测序时Matrix等条件的错误。Q:测序结果不好，测序峰比较乱，基线不平，测许公司说含有复杂结构，现急需要该序列，请问高手这种情况该怎么办？有什么测许方法？A；我自己曾经亲自做过测序，对于这种情况，一般是有解决的方法的。不过公司不愿意为了你自己的一个样品去专门摸索条件。1． 最大可能是提取的质粒不纯，可以将质粒再次转化后挑单克隆重做（很奏效）。2． 直接在测序前的模板热变性使用86度，5分钟而不是大多数的96度3分钟3． 实在不行切后分别放到T载体上，一般都可以保证顺利读出序列。最后值得一提的是如果能自己根据理论序列给设计几个比较合理的测序引物可能一切就OK了。Q:上星期将我的PCR纯化产物拿到TAKARA测序，结果今天公司打电话来说测了100多个bp就读不下去了，建议我克隆后再测，我的PCR产物纯化只有很亮的一条带，不知道为什么测不出来。答：测不下去的原因主要是序列里面有困难序列，二级结构或短序列重复，比如发卡结构和AT长重复等，甲基化的影响不大清楚，本人认为不会影响测序。所以，PCR产物测不下去的话，克隆后也很难保证测过去。其实就测序来说，PCR产物还是质粒都无所谓，只要样品纯可以了。正向测不通反向再测也可能会测通，因为DNA中正链和反链二级结构不是完全一样的，正链中遇到困难序列在反链中可能相对简单，测序酶可能可以急需合成DNA。另外，还可以改一下测序PCR的反映条件等等，也可以测通。

近日，美国 FDA 审批通过 Illumina 公司的 MiSeqDx 台式新一代测序仪及配套试剂盒，成为全球首个而且是目前唯一一个获得 FDA 临床认证的新一代测序（NGS）平台。通过认证的试剂盒除了针对囊性纤维化的检测之外，还包括通用试剂盒，让临床实验室能够开发他们自己的诊断检测。美国 FDA 医疗器械与辐射健康中心的官员 Alberto Gutierrez 博士认为：“NGS 正在改变我们了解基因组学的方式。在这之前，测序与特定疾病相关的基因是个漫长而昂贵的过程。今天，我们能够在单个检测中非常快速地读取和解释大的 DNA 片段，而这一信息丰富的技术日渐普及，能够被医生用于患者护理。”此次通过 FDA 认证的两项分析分别是 MiSeqDx Cystic Fibrosis 139-Variant Assay 和 MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Assay，它们可用于囊性纤维化的筛查和诊断。囊性纤维化是一种常见且致命的遗传疾病，在欧美人群中较为常见。在美国约有 1000 万名携带者，而患病人数超过 3 万名。此疾病由囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因的突变引起，有着广泛的临床表现，这取决于哪些CFTR基因突变存在。大部分CFTR突变是罕见的，其分布和频率随群体而异。MiSeqDx Cystic Fibrosis 139-Variant Assay 旨在同时检测CFTR基因中的 139 个临床相关的致病突变及变异，包括 ACMG 和 ACOG 建议筛查的那些。MiSeqDx Cystic Fibrosis Clinical Sequencing Assay 则凭借 Illumina 的靶向重测序技术，为 CFTR 基因的蛋白编码区域和内含子/外显子边界提供高度准确的数据。美国国立卫生研究院（NIH）的院长 Francis Collins 也是一名囊性纤维化的研究人员。他在一份声明中指出，这一具有里程碑意义的举措，将有助于实现个性化医疗的承诺。他认为，高通量 DNA 测序仪的出现让医生能够全面查看患者的基因组，以便搜索各种变异或突变，它们可能增加疾病风险，推动疾病进程，和/或影响药物反应。这些信息有可能在很多方面让患者受益。不过激动归激动，他认为目前还有很多工作要做。Francis Collins 博士和 FDA 局长 Margaret Hamburg 在《新英格兰医学杂志》上联名发文，称测序平台在临床应用中的批准将为医生在患者护理中更广泛地采用遗传信息铺平道路。不过，他们也指出，尽管目前已取得一些进展，但仍存在政策、法律和监管问题，而新发现也必须得到验证。此外，医生、医疗保健工作人员和患者仍需要支持和帮助，才能了解基因组数据。他们谈道：“新一代测序到达这一监管里程碑仅仅是个开始。我们需要共同努力，以确保研究进展和基因组信息的临床应用是基于严谨的证据。”原文检索：Francis S. Collins, and Margaret A. Hamburg. First FDA Authorization for Next-Generation Sequencer. NEJM, November 19, 2013; DOI: 10.1056/NEJMp1314561

2010年2月，罗森伯格的Ion Torrent公司推出了世界上第一台半导体测序仪——PGM，这也是首台“桌面型”（benchtop）测序仪。PGM的测序原理不同于此前的测序技术。随着2011年三款新的测序平台的发布，此领域的变革步伐不断加快。这三款新平台分别为：Ion Torrent的PGM、Pacific Biosciences的RS和Illumina的MiSeq。研究人员发现，Ion Torrent、MiSeq和PacBio RS技术所产生的数据对富含GC、中性和富含AT的基因组都表现出近乎完美的覆盖，只是在利用PGM对富含AT的恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）基因组进行测序时，有大约30%的基因组无覆盖。这三台快速周转的测序仪都能够产生有用的序列。然而，就数据质量和应用而言，还存在很大差异。产量有限且每个碱基的费用高阻碍了大规模测序项目在PacBio仪器上的开展。从实用性和流程方便性来看，PGM和MiSeq相当接近。决定购买哪一台将取决于可利用的资源、现有设施和人员的经验，当然，资金和应用也要考虑.虽然目前个人化基因测序仪更多地还是用于科研，但对它在临床上的应用，是Life公司和IIIumina公司当下都在积极推进的最重要的方向。 Life在2011年7月就PGM的临床应用，向FDA提交了申请。IIIumina公司也紧随其后：“我们正在申请FDA对MiSeq的审批。MiSeq在设计过程中就考虑到了特定的临床应用环境，我们相信这个系统的许多特征会有助于它获得FDA的批准。