细胞周期分析

2015年2月3日讯 /生物谷BIOON/ --近日，著名国际期刊Nature Protocols在线刊登了来自美国NIH Tom Misteli研究小组的一项最新研究成果，他们提出了一个利用荧光显微镜确定单个细胞周期的实验方法。应用这种实验方法或可实现对群体中不同个体细胞周期的监测观察。　　细胞周期进展是细胞最基本特征之一，传统上对细胞周期的研究主要依赖于群体分析，并通过周期相关特异性标记或者使用基因修饰系统的方法来确定，这使得对稳定的单细胞周期的确定变得非常困难。因此，研究人员提出一个应用高分辨率成像的荧光显微镜测量DNA含量来确定单个细胞周期的实验方案，这种方法是基于对DNA的染色，通过图像分析精确定量完整细胞核的荧光强度，并且能够与其他组化方法联合使用。Tom Misteli研究小组开发的双通道自动图像分析算法，结合商业软件或者开源软件能够导出对不同个体细胞周期的描述。这个实验方案适用于贴附细胞并且可使用几种不同的DNA染料。　　综上所述，该文章提出了利用DNA染色结合荧光显微镜检测的实验方法来判断单个细胞的周期进程，或对精确研究群体中单个细胞的周期具有重要意义。

为了对衰老细胞的分子特性进行进一步的理解，美国梅奥医学中心Jan M. van Deursen研究组与Hu Li研究组通过筛选不同的应激因素、细胞类型以及在哺乳动物体内寻找与衰老相关的增强子，希望能够鉴定出免疫系统识别衰老细胞的关键因素。这项工作发表在Science上题为p21 produces a bioactive secretome that places stressed cells under immunosurveillance。研究发现细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子p21除了经典的细胞周期阻滞的作用之外，会作为免疫监视“侦察兵”以及“计时器”的作用帮助机体建立内在的监察机制，促进衰老细胞的清除，确保机体的稳态。为了对衰老细胞在分子水平上进行更深入的了解，作者们希望鉴定衰老相关的超级增强子所控制的基因。在最初的筛选中，作者们使用了小鼠胚胎成纤维细胞这一体外系统，并且应用在三种不同的衰老诱导应激胁迫条件：γ-射线、过度复制以及癌基因诱导。作者们绘制了细胞过渡到衰老状态后超级增强子以及与这些超级增强子相关的转录激活基因，从中作者们找到了p21这个被调控的基因位点。p21是一个传统的细胞周期抑制因子，在筛选中发现该基因位点引发了作者们的兴趣， 这可能暗示了p21在衰老细胞中还具有其他的功能。为此，作者们在细胞中敲降了p21，发现衰老相关的基因表达中有三分之一是p21依赖的，因此作者们将这种表型称为p21激活的分泌表型（p21-activated secretory phenotype，PASP）。在受到影响的因子中，作者们将目光集中在Rb（Retinoblastoma protein）蛋白之上，因为在p21敲降后Rb在衰老细胞中缺失并且会降低衰老相关分泌表型的减弱。因此，p21是通过降低Rb的磷酸化对SASP产生影响。为了进一步地探究p21介导的Rb低磷酸化水平是如何激活衰老相关分泌表型基因的，作者们对调控不同衰老相关进转录因子以及不同衰老条件所产生的RNA-seq数据进行分析。作者们发现Rb会促进衰老细胞中这些关键转录因子的转录活性，从而建立起p21依赖的衰老相关分泌表型的产生。另外，作者们还发现p21所控制的转录程序是响应应激胁迫的第一道关，会在细胞周期阻滞的情况下开启机体的免疫监控。但是p21的这种免疫监控是如何开启的呢？作者们对衰老相关的分泌表型因子进行分析，发现小鼠胚胎成纤维细胞来源的p21依赖的分泌因子中包括Cxcl14，这是CXC家族趋化因子之一，会作为多种免疫细胞化学引诱剂发挥作用【1】。为了验证p21是否是由CXCL14开启机体的免疫监控的，作者们在实验系统中加入了CXCL14中和抗体，发现在加入后巨噬细胞被引诱后迁移的现象会消失。为了进一步在体内的系统证明这一观点，作者们对构建了标记的p21小鼠品系，p21过表达后肝脏细胞会出现显著的衰老特征，比如laminB1缺失以及HMGB1的核挤出等。但是随着时间的流逝，p21过表达的肝脏细胞数量显著降低，说明这些衰老的细胞会被清除。而再加入中和抗体后，衰老细胞的清除现象就会消失。那么p21所介导的衰老分泌表型因子的是否是特异的呢？为此作者们构建了p16以及p27的过表达品系。p16与p21相比是一个更为特异的细胞周期依赖性激酶抑制因子，只靶向G1-CDK。作者们发现p16也会出现显著的细胞周期抑制，但是并不能促进巨噬细胞的迁移。同样的，p27会作为在细胞终末分化的细胞周期发挥作用，而不似p21。因此，细胞周期阻滞与免疫监控是p21而非其他细胞周期依赖性抑制因子的特征。通过癌变诱导的应激胁迫，作者们证明了在癌基因诱发的应激胁迫中p21所介导的免疫监控作用也会发挥功效，从而作为应对胁迫的第一道防线保护机体的健康和稳态。但应激诱导的致癌点突变是不可修复的，但细胞一般来说遇到的很多应激胁迫都是短暂的或者是可以修复的。那么p21依赖的衰老分泌表型是否可以对可逆的应激胁迫进行响应呢？作者们构建了慢病毒载体的p21小鼠品系，在阿霉素（Dox）作用的情况下会产生符合p21过表达的表型，而在去除阿霉素后p21的水平会逐渐恢复正常，作者们发现p21恢复正常水平后，p21依赖的衰老分泌表型缓解下来，巨噬细胞会从应激胁迫的上释放，细胞的免疫监控状态停止。总的来说，该工作鉴定发现了经典的细胞周期蛋白依赖性激酶p21在应激状态下作用“侦察兵”发挥免疫监控作用（图1），通过促进细胞释放趋化因子CXCL14等招募巨噬细胞，清除机体中危险的存在，同时又具有生物内在“计时器”功能，在应激胁迫撤出的情况下促进衰老分泌表型的缓解，从而解除多细胞内的警报，促使机体恢复正常状况。同期刊发观点文章对该文章进行介绍题为Clearing stressed cells，介绍了该工作中鉴定发现p21不仅对于衰老细胞的周期阻滞有关，还会早期阶段对受到胁迫的细胞进行免疫监控，清除受到胁迫的细胞。在细胞对内在环境进行修复，促使p21恢复正常水平后，可以使得巨噬细胞解离。但是应激胁迫造成的威胁超过细胞的修复能力后，细胞依赖于p21所释放的CXCL14等在内的趋化因子会招募巨噬细胞，巨噬细胞激活后招募T细胞，从而维护多细胞内环境的稳态。原文链接：https://doi.org/10.1126/science.abb3420

近日，一项刊登在国际杂志Cell Reports上的研究报告中，来自伊利诺伊大学的科学家们通过研究发现，细胞尺寸和细胞的周期状态或许在HIV中扮演着关键的决定性作用。如今抗逆转录病毒药物的开发使得HIV感染成为了一种可控的慢性疾病，然而如果未能及时诊断或治疗，HIV感染就会进化成为AIDS（获得性免疫缺陷综合征），2017年全球大约有100万人因感染HIV而死亡。挽救生命的药物并不能治疗HIV，因为当HIV感染机体后其会偷偷地靶向作用诱发机体抵御任何感染的免疫反应的细胞，尤其是HIV会入侵CD4 T细胞，并不断复制最终接管CD4宿主细胞的DNA。研究者Roy Dar教授说道，当感染CD4 T细胞后HIV会经历两种命运中的一种，其要么会整合成为复制状态，诱发成百上千个感染性病毒颗粒的产生；要么会进入一种休眠状态。这项研究中，研究人员重点分析了如何有效清除HIV潜在的病毒库，因为HIV病毒库会自发激活并且躲避药物疗法的攻击，如果HIV感染者没有严格遵守抗逆转录病毒药物体系的治疗，其机体中的病毒库就会激活从而引发感染者出现一系列疾病症状。截至目前为止，并没有一种有效的方法能够区分出机体中未感染的细胞和潜在感染的细胞，而诸如这种策略就能够支持当前科学家们治疗HIV感染的疗法。这项研究中，研究人员在实验室中调查了被HIV潜在感染的T细胞的重新激活的过程，他们构建出了一种携带绿色荧光蛋白（GFP）的特殊病毒结构，当细胞重新激活时GFP就会发生表达。研究者所开发的延时单细胞成像技术能够通过计算GFP的平均荧光强度来监测单个细胞从沉默状态到活跃状态的重新激活过程；一旦研究人员鉴别出重新激活的细胞后，他们就会对细胞的尺寸进行计算，并确定重新激活所需要的细胞平均参数，结果发现，在潜伏的细胞群体中，只有较大尺寸的细胞会恢复活性，而较小的细胞则会保持沉默。据研究者介绍，较大的宿主细胞尺寸或能提供一种天然的细胞机制来帮助增强病毒表达所需要的细胞裂解量，同时当病毒决策发生偏离时也能够帮助破坏病毒的潜伏状态。Dar说道，这项研究中我们提出了一种被动性的宿主细胞主导病毒制定决策的案例，当宿主细胞尺寸较小时病毒就不会发起攻击，只有当宿主细胞尺寸较大时病毒才会被重新激活。此外，研究者还发现，细胞从潜伏状态过渡到活性状态依赖于细胞的周期（即细胞中DNA复制的阶段），同时其还受到了药物疗法的调节；研究者表示，我们可以使用药物疗法来调节特定细胞周期状态内外的细胞数量，从而感染HIV的激活决策；本文研究结果有望帮助研究人员开发抑制HIV感染的新型策略和疗法，后期研究人员还希望通过更为深入的研究来阐明细胞尺寸和周期状态如何影响HIV的感染决策。