电剪刀

最近，由于一名中国留学生的“倒戈”邮件曝光，围绕“基因剪刀”CRISPR技术的专利战再掀波澜。这场专利之争不仅涉及巨大的经济利益，还会影响将来谁可能获得诺贝尔奖。这个引人注目的事件也为正走向世界舞台的中国科学家上了知识产权保护的生动一课。　　专利争夺战　　自2012年诞生以来，CRISPR基因编辑技术以横扫之势风靡整个生物学界。科学界普遍认为，这是21世纪以来生物技术方面最大的一个突破。但随之而来的是举世瞩目的专利争夺战，一方是加利福尼亚大学伯克利分校的研究者，另一方是麻省理工学院和哈佛大学共同创建的布罗德研究所的研究者。　　事件的大概情况是，伯克利分校的珍妮弗道德纳等人2012年6月首先在线发表了有关CRISPR技术的论文，并在此之前1个月率先提交专利申请 而布罗德研究所的张锋等人后来居上，虽然论文发表和专利申请晚了一步，但他们首次证明CRISPR技术能应用于人类细胞的基因组，反而获得了CRISPR技术的第一个专利。这意味着美国专利商标局承认张锋是CRISPR技术的发明人。　　目前双方在专利官司中各执一词，为此花费了大量的时间与金钱。美国专利商标局已于今年1月宣布，将重新评估CRISPR专利归属。张锋一方对媒体透露，他们仅今年就已经花费了1090万美元的律师费来捍卫他们的CRISPR专利。　　没想到，原张锋实验室成员林帅亮2015年2月写给道德纳的一封求职邮件于今年8月曝光。这封带着“投名状”性质的邮件声称，张锋及其学生丛乐是在看到道德纳的论文后，才将研究方向迅速转向CRISPR的，所以把专利给张锋是错误的。布罗德研究所立即予以回击。丛乐在发给新华社记者的声明中说，“很震惊”，林帅亮的描述“与事实完全不符”。　　“基因剪刀”热　　CRISPR专利之争白热化，从一个侧面显示出“基因剪刀”之热。基因编辑技术早在上世纪90年代就出现了，但相比此前的技术，CRISPR技术具有成本低、易上手、效率高等优势，使得对基因的修剪改造“平民化”，无论实验室大小都能使用，所以只有4岁的CRISPR技术已三度入围美国《科学》杂志年度十大突破，更在2015年被《科学》评为年度头号突破。　　与CRISPR技术有关的论文数量爆发式增长，很好地说明了它在科学界的热度。2013年，相关论文只有280篇左右，但2014年和2015年，这方面的文章分别增长至670篇和1200多篇，而今年上半年已经发表了约1000篇。科学界普遍认为，如果CRISPR技术没有被新的技术突然取代，那它的发明者一定会获得诺贝尔奖。不过，也有观点认为，鉴于该技术的发明人存在争议，也许得奖会晚那么几年。　　CRISPR技术的“钱”景更是被资本市场看好。张锋成立了埃迪塔斯医药公司，道德纳参与创建了卡布里生物科学公司和英特利亚医疗公司。这3家公司已先后获得约3亿美元的融资。德国亥姆霍兹传染研究中心的埃马纽埃尔沙彭蒂耶是道德纳研发CRISPR技术的合作者，沙彭蒂耶帮助创建的CRISPR医疗公司将在未来5年获得制药巨头拜耳至少3亿美元的投资。　　尽管与CRISPR技术相关的基因疗法、细胞疗法、免疫疗法、药物开发等人类健康方面的应用还处于早期阶段，但正如美国蒙大拿州立大学保罗范埃尔普等人2015年的一篇述评文章所言，这个市场正在经历“狂热增长”。有人估计，CRISPR技术带来的商机可能高达460亿美元。　　知识产权课　　这场专利大战也给中国科学家上了知识产权保护的生动一课。关注这件事的人可以发现，道德纳和张锋都是在论文发表前就申请专利，这表明美国科研人员有保护知识产权的强烈意识。而在中国，虽然高质量科研产出正迅速增多，但中国学者对专利保护工作的重视却远远不够。做好知识产权保护，是与科研人员自身利益直接挂钩的，这也是做好科技成果转化工作的一个重要组成部分。　　道德纳的经历还告诉我们，发表论文并不等于就拥有了该项技术的所有权 而张锋申请专利时通过支付额外费用而获得快速通道审核，这说明专利申请同样得抓紧。屠呦呦因为抗疟药青蒿素的工作而获得诺贝尔奖，但由于历史原因，她只是发表了论文，有关专利保护工作并不完善，因此中国其实没有从中获得多少经济利益。这样的教训不应再发生。　　一个好的经验是，各个科研机构也许应像美国那样成立技术转移办公室，由专职人员帮助科研人员申请专利，推进科研成果转化。

p style="text-indent: 2em text-align: justify "致病菌对抗生素产生耐药性已成为日益严峻的全球性公共卫生问题。美国研究人员近日报告说，他们利用“基因剪刀”开发出一个新系统，可以确定某种特定抗生素能靶向作用于致病菌的哪些基因，有望用于改进现有抗生素效果或开发新型抗生素。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "被誉为“基因剪刀”的CRISPR基因编辑技术能精确定位并切断DNA（脱氧核糖核酸）上的基因位点，可以关闭某个基因或引入新的基因片段。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "美国威斯康星大学麦迪逊分校等机构研究人员近日在英国《自然· 微生物学》杂志上报告说，CRISPRi是“基因剪刀”的弱化版，不能切断DNA链，但能附着在DNA的某个位置，阻止基因转录所需蛋白质分子靠近，以达到降低基因表达、减少该基因编码蛋白质数量的效果。他们开发出的这个新系统被命名为“移动CRISPRi”，可适用于研究不同菌种。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "研究人员发现，利用这种基因编辑技术，减少被某种抗生素作为“靶子”的蛋白质数量时，细菌会变得对这种抗生素更敏感，这证明了特定抗生素和某些基因之间的关联。通过这种方式，研究人员一次可以筛查出数千种可能成为抗生素潜在目标的基因，可帮助科学家理解抗生素的工作机制并改进药物效果。/pp style="text-indent: 2em text-align: justify "研究人员用“移动CRISPRi”研究了从奶酪皮中分离出的干酪弧菌，以弄清这种细菌怎样聚居到奶酪上并影响风味。研究人员说，“移动CRISPRi”可用于研究任何数量的科学家此前不了解的致病菌或有益菌。/p

隔八年，曾广受关注的小麦白粉病“缉凶案”终于迎来了续篇。　　中科院遗传与发育生物学研究所研究员高彩霞团队和中科院微生物研究所研究员邱金龙团队用多重“基因剪刀”，实现了对小麦重要感病基因序列的精准操控，获得了既高抗白粉病又高产的新材料。相关研究2月10日发表于《自然》。这意味着，号称小麦三大病害之一的白粉病终于被我国科学家“拿下”。　　“这一具有重要理论与实际应用价值的研究工作，将成为作物育种领域标志性的成果。”中国工程院院士、西北农林科技大学康振生对此评论说，它展现了基因组编辑在作物分子设计育种中的巨大潜力，对保障粮食安全具有重大意义。　　“另一只靴子”落地　　据农业农村部统计，我国每年受白粉病影响的小麦面积达到1亿亩左右，重病田甚至会减产40%。将这一严重威胁粮食安全的真菌“缉拿归案”，是很多育种专家的梦想。　　目前，分子育种家都是通过抗性基因帮助作物抵抗白粉病。但就像病毒预防一样，这种途径不具有广谱性和持久性，很容易随着白粉病新小种的出现而失去效用。　　病原菌的成功侵染需要利用植物感病基因，能否通过阻断这个病害与植物连接的“桥梁”来获得广谱持久的抗性呢？　　这是科学家想做但又不敢去做的一件事，因为感病基因的敲除具有两面性：抗病的同时，也会影响植物生长。　　科学家很早就知道MLO是小麦的感病基因，但由于普通小麦是异源六倍体，MLO基因有3个拷贝，几乎不可能通过天然突变方式同时敲除这3个基因。2014年，合作团队利用“基因剪刀”定向敲除MLO的3个拷贝，不出所料地获得了对白粉病具有广谱持久抗性的小麦新材料。　　相关研究在《自然—生物技术》发表后引起了世界范围内的极大关注。该研究入选了该刊创刊20周年最具影响力的20篇文章，并入选《麻省理工科技评论》2016年“全球十大技术突破”。高彩霞也因引领了植物基因组编辑的浪潮，入选《自然》2016年度“十位中国科学之星”。　　不过，这个故事还有后续——正如在其他多种植物中观察到的一样，研究团队发现敲除感病基因MLO的小麦出现了一定程度的负面表型，如早衰、植株变矮、产量下降等，限制了其在生产上的广泛应用。　　对此，研究团队选择迎难而上。　　在当时敲除MLO后得到的100多个基因组编辑小麦突变体中，他们发现了一个“宝贝”材料——突变体Tamlo-R32。它在表现出对白粉菌的抗性的同时，生长发育和产量完全正常。　　这个与众不同的材料让高彩霞坚信，感病基因突变抗病并非“死胡同”，“沿着这条路走一定能够做成”。　　现在，经过八年协力攻关，“另一只靴子”终于落地。在发表于《自然》的新研究中，他们解开了Tamlo-R32突变背后的秘密，克服了感病基因MLO突变引起的负面表型，实现了抗病高产“鱼与熊掌”的兼得。　　层层推进破悬疑　　在敲除MLO得到的大量突变体中，Tamlo-R32为何一枝独秀？这个产量甚至超过普通野生型小麦的材料是怎么出现的？如何通过基因组编辑获得该突变体并将其导入小麦主栽品种中？　　2014年之后，围绕Tamlo-R32这个“主角”的系列悬疑，成为高彩霞和合作者要破解的谜题。　　但这做起来并不容易。　　普通小麦基因组十分庞大，是人类基因组的5倍、水稻基因组的40倍。其序列重复性相当高，基因组结构极为复杂。　　一开始，由于小麦基因组数据并不完善，研究团队只能通过一系列漫长的传统遗传学实验进行分析，最终确定在小麦3个染色体组A、B、D中，A和D基因组上都存在预期的突变。　　“只有这两个基因组发生改变，还不足以抵抗白粉病，所以B基因组上一定有问题。”高彩霞说，受限于当时的基因组数据，研究团队在这个问题上探索了4年始终未能解决。　　直到2018年，借助新完成的小麦基因组重测序数据和染色体精细图谱，这个“暗箱”终于被打开了。　　让研究团队吃惊的是，Tamlo-R32突变体的B基因组上竟然发生了高达304Kb（超过30万DNA字母）的大片段删除——这导致该突变体的染色体三维结构被改变，使上游基因TaTMT3（与糖转运蛋白相关）表达水平上升，进而克服了感病基因MLO突变引起的负面表型，最终实现了抗病和产量的“双赢”。　　悬疑破解了，但要精确实现304Kb这一大的基因组片段剪切，并非易事。“‘剪刀’的效率要特别高。”高彩霞对《中国科学报》说，抗白粉病基因编辑研究十年来，目前已拥有7项核心技术专利，研究团队还开创了一系列基因组编辑新技术。　　正是基于这些核心技术，研究组通过叠加使用“基因剪刀”，在敲除MLO感病基因的同时，删除了TaMLO-B附近的大片段DNA，从而成功将这一抗病高产优异性状引进到我国多个小麦主栽品种中。　　由于MLO的基因功能在不同植物中相对保守，研究者进一步发现，在模式植物拟南芥中过表达TMT3也能克服其感病基因突变产生的负面表型。“这证明了叠加的遗传改变可以克服感病基因突变带来的生长缺陷，为作物抗病育种研究提供了新的理论视角。”论文第一作者、邱金龙团队助理研究员李盛楠说。　　至此，研究团队终于讲完了利用感病基因进行小麦抗病育种的故事。回顾其中的挑战，高彩霞有些风轻云淡地说：“我们知道路就在那里，只要坚持不懈就一定能够到达。”　　这个历经“八年抗战”取得的研究成果获得了审稿人的一致好评。多位审稿人表示这项研究“具有很大应用潜力”。其中一位审稿人指出：“这项工作在探索没有负面效应的抗病小麦育种上迈出了重要一步。”　　基因编辑除了“剪刀”还是“橡皮”和“铅笔”　　“基因组编辑的一个优点是可以更方便、快捷、精准地进行作物育种和改良。”李盛楠说，研究团队用了数年时间了解Tamlo-R32的突变机制后，仅用了几个月就利用基因组编辑技术在多个小麦主栽品种中获得了抗病且高产的种质资源。而传统杂交育种则需要五六年的时间。　　在2019年和2020年于北京和河北赵县进行的大田试验中，联合团队进一步证明了新种质资源的可靠性：常规MLO突变体造成的株高矮化在10%左右，产量降低16%左右；而新突变体具有超出或至少保持与亲本一致的产量。　　“培育和推广抗病新品种是防治植物病害最经济、高效和环境友好的策略。”康振生评论说，“这项研究验证了基因组编辑技术的发展对作物性状改良具有重大推动作用，尤其对经典遗传改造难以实施的多倍体复杂基因组农作物的改良，对保障粮食安全具有重要意义。”　　“和传统育种技术相比，基因组编辑育种的优势非常明显。”高彩霞对比说，传统杂交育种要引入一个抗病基因，需要进行6~8代的回交，整个过程非常漫长，而且其前提是杂交的亲本种要有抗病基因。通过突变育种（辐射、化学诱变等方法）具有盲目性和随机性，找到理想的突变体无异于大海捞针。而基因组编辑为精准定向育种提供了可能。　　“通过基因组编辑可以不添加任何外源性的基因，只需要把靶向的序列修改好，大大节省了时间、减少了工作量。”她补充说。　　高彩霞指出，基因组编辑技术经过10年的发展已经不仅仅是“一把剪刀”的概念。进化至“2.0时代”的碱基编辑和引导编辑还可以是一块“橡皮”或一支“铅笔”。“如果一个序列有点多，你可以把它剪掉；如果组成DNA的四个字母ATCG有一个错了，你可以用‘橡皮擦’把它擦掉，然后用‘铅笔’写入正确的字母，而‘铅笔’‘橡皮擦’是不留在细胞里的。”　　好消息是，今年1月底农业农村部制定公布了《农业用基因编辑植物安全评价指南（试行）》，进一步规范了农业基因编辑植物的安全评价管理，促进我国生物育种技术和产业发展。“在这个政策的鼓舞和鞭策下，相信我国很快会有更多的基因组编辑材料进入田间和市场。”高彩霞表示，下一步将深入开展小麦白粉病新种质资源的开发和推广应用。　　相关论文信息：https://doi.org/10.1038/s41586-022-04395-9