单克隆抗体(mAb)在用于治疗各种疾病中，由于其良好的治疗效率，良好的药代动力学和药效学以及相对较低的副作用而特别受到关注。单克隆抗体是一种4聚体糖蛋白，分子量约为150 kDa，由两条重链和两条轻链组成，通过几个二硫键相互连接，并在Fc域中具有至少一个保守的N-糖基化位点。糖基化是转录后修饰，是抗体在从表达系统排泄到细胞外培养基期间自然发生。它仅占蛋白质总质量的2%至5%，但由于其对mAb的疗效具有显著的影响，因此，mAb的糖基化状态被认为是制备抗体的关键的质量属性。因此开展单克隆抗体的糖基化的分析研究具有十分重要的意义。 众所周知，尽管反相液相色谱是至今应用最广的色谱分离技术，它能与各种常规的检测方法结合，解决多种分析应用问题，但对某些分析物，特别是极性和亲水性化合物却无法或很少保留。正相液相色谱是一种重要的补充，但是其流动相常常采用己烷或环己烷。这种条件下，很多极性和亲水性化合物特别是生物样品，往往很难溶解，从而限制了正相色谱的应用。亲水作用色谱(HILIC)使用的流动相与反相液相色谱相相差不大，十分适合与质谱检测器或蒸发光散射检测器联用。而且，在分析亲水化合物时，如将反相色谱改换成亲水作用色谱，检测灵敏度通常会提高几个数量级。针对目前的糖类化合物的分析，一些研究表明由于其极性较大，在反相色谱上保留太弱甚至不保留；而在正相色谱上又保留过强，难以被非极性的流动相洗脱下来。亲水作用色谱作为一种分离极性化合物的液相色谱模式，糖类化合物的分离因此成为其最典型的应用领域之一。另外，关于糖类物质的分析方法，特别是蛋白质的糖链分析，较多的文献是糖组学的研究。这些研究多以提供更多的糖基化位点或糖链的种类信息为分析目的。但是，糖链的生物功能活性的研究常常需要定量分析的技术，目前相关的研究仍旧采用同位素标记法来实行相对定量的分析；显而易见，这样的方法存在安全性及可操作性相对不佳的问题，因此需要发展相关的定性定量分析技术。 为此，本研究采用亲水作用色谱开展了以西妥昔单抗为例的N-糖链的定量分析和解析技术的研究，即建立一种利用液相色谱荧光检测器(HILIC-FLD)定量分析N-糖链的分析方法，旨在实现糖链的精确定量，为后续研究其功能活性做铺垫；同时也建立一种利用液质联用分析技(HILIC-ESI-MS)定性解析西妥昔单抗N-糖链种类的方法，确认相关糖链的结构信息。结果表明，对于常见的3种N-糖链G0F、G1F、G2F，其线性范围分别为7.510-11～1.510-8、4.510-11～9.010-9、以及7.510-11～4.510-9mol/L；检测下限分别为2.810-11、2.510-11、2.610-11 mol/L；保留时间和峰面积的RSD值均小于3%，方法的回收率均大于95%。采用酶切N端糖链和2-氨基苯甲酰胺标记法可以实现西妥昔单抗的这3种N端糖链的含量分析，分别为86.0、85.1、16.6g/g。除了上述3种糖链，还利用UPLC-ESI-MS进一步对西妥昔单抗其他6种相对丰度较高的N-糖链的种类进行解析。这些研究不仅可以应用于单抗药物的N端糖链的质控分析，而且对其糖链种类进行解析以实现更多的生物学研究。