草鱼呼肠孤病毒2型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒Grass carp reovirus(GCRV)

本产品仅供科研

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产品名称：草鱼呼肠孤病毒2型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒Grass carp reovirus(GCRV)

1. 即开即用，用户只需要提供样品 DNA 模板。

2. 引物和探针经过优化，灵敏性高。

3. 提供阳性对照，便于区分假阴性样品。

4. 特异性高，不会跟其他微生物的 DNA 发生交叉反应。

5. 既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为 5个数量级。

6. 本产品足够 50 次 20μL 体系的探针法荧光定量 PCR 反应。

7. 本产品只能用于科研。

包装规格及成分（具体信息详见说明书）：

草鱼呼肠孤病毒2型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒Grass carp reovirus(GCRV)操作过程：

一、稀释标准曲线样品（以 10E1-10E6 拷贝/μL 这6 个10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA 片段作为阳性对照。

1. 标记 6 个离心管，分别为 6，5，4，3，2，1。

2. 用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同。

3. 在 6 号管中加入 5 μL 1×10E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

4. 换枪头，在 5 号管中加入 5 μL 1×10E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

5. 换枪头，在 4 号管中加入 5 μL 1×10E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1×10E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。

6. 重复上面的操作直到得到 6 个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品 DNA 的制备

1. 如果有 N 个样品待提取，最好设置 N+2 个提取，多出的是PC（样品制备阳性对照）和 NC（样品制备阴性对照）。可以取阳性对照的1000倍稀释液10μL 再加上一定量的水，使总体积与待提取样品的规定体积一致，以此作为 PC。另外用水作为 NC。

2. 用自选方法纯化样品的 DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容。

三、设置qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）

如果进行定量分析，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照，6个用于标准曲线样品。如果做定性分析，则6个标准曲线样品只选一个做（可以选4号，其余样品不变）。以下只介绍定量分析的反应设置。

四、数据处理

1. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log 值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品核酸浓度的 log 值，再推算出其浓度。

2. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照Ct 必须大于或等于 40。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲

线，Ct 值应该小于或等于 39。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于40 则为阴性，如果小于或等于 39 则为阳性。如果在 39-40 之间，

则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40，则为阳性。

成分	样品管N+2个	RT-PCR阴性对照管	标准曲线样品管 （2-7 管）
探针法qPCR缓冲液	各 10 μL	10 μL	各 10 μL
探针法 qPCR 酶混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
qRT-PCR探针	各 1 μL	1 μL	各 1 μL
探针qRT-PCR 引物混合液	各 2 μL	2 μL	各 2 μL
待测样品 RNA 模板	各 5 μL	--	--
超纯水	--	5 μL	--
第 7 步所得标准曲线样品稀释液（2-7 号）	--	--	各5 μL（2号样到2号管，3号样到3 号管…）

1. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 qRT-PCR：

过程	温度	时间
逆转录	50℃	30 min
预变性	94℃	10 min
qRT-PCR 反应（40 个循环）	94℃	15 sec
	60℃	1 min（采集 FAM 通道的荧光信号）

保存条件：-20℃

保质期：12个月

草鱼呼肠孤病毒2型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒Grass carp reovirus(GCRV)检测方法的局限性

A.样本检测结果与样本收集、处理、运送以及保存质量有关；

B.样本提取过程中没有控制好交叉污染，会出现假阳性结果；

C.阳性对照、扩增产物泄漏，会导致假阳性结果；

D.病原体在流行过程中基因突变、重组，会导致假阴性结果；

E.不同的提取方法存在提取效率差异，会导致假阴性结果；

F.试剂运输，保存不当或试剂配制不准确引起的试剂检测效能下降，出现假阴性或定量检测不准确的结果；

草鱼呼肠孤病毒2型探针法荧光定量RT-PCR试剂盒Grass carp reovirus(GCRV)注意事项

1操作严格按照说明书进行；

2试剂盒内各种组分使用前应自然融化，完全混匀并短暂离心；

3反应液应避光保存；

4反应中尽量避免气泡存在，管盖需盖紧；

5使用一次性吸头、一次性手套和各区专用工作服；

6样本处理、试剂配制、加样需在不同区进行，以免交叉污染；

7实验完毕后用10%次氯酸或75%酒精或紫外灯处理工作台和移液器；

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