苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸微板法)实验操作

苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸微板法)

产品简介：

苯丙氨酸解氨酶(L- phenylalanine ammonia-lyase，PAL)是催化直接脱掉L-苯丙氨酸上的氨而生成反式桂皮酸的酶，该酶多存在于高等植物、酵母、菌类可溶性部分物质，是1961年J.Koukol在大麦中发现的，推测其分子量约为30万，这是一个可把苯丙氨酸用于酚类化合物合成的酶。在组织中的活性可随外界因素而发生显著变化，用光照、病伤害、植物激素处理等会使活性显著增加，在多数情况下在组织中活性增加时，酶发生失活作用，这时组织中具有活性酶的量很快就会减少，据认为这种失活是与类蛋白质物质作用有关，测定细胞木质素合成途径中间代谢物及关键酶活性,可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。

雅吉生物苯丙氨酸解氨酶(PAL)检测试剂盒(苯丙氨酸微板法)检测原理是以苯丙氨酸作为底物，在酶促反应的最适条件下采用每隔一定时间测定产物生成量的方法，于酶标仪290nm 处检测吸光度，以吸光度变化所需酶量进行计算，主要用于植物组织的裂解液或匀浆液、血清等样品中内源性的苯丙氨酸解氨酶活性,尤其适用于检测水果中苯丙氨酸解氨酶活性。

该试剂盒仅用于科研领域，不适用于临床诊断或其他用途。

产品组成：

自备材料：

1、蒸馏水

2、电子天平、研钵或匀浆器、离心管或试管

3、低温离心机、恒温箱或水浴锅、酶标仪、酶标板

操作步骤(仅供参考)：

1、准备样品∶

①植物样品︰取1g植物组织或水果中层果肉，加入2.5ml PAL Lysis Buffer，冰浴情况下充分捣碎研磨或匀浆，4℃ 10000r/min离心15~20min，留取上清液，-20℃冻存，用于苯丙氨酸解氨酶的检测。

②血浆、血清和尿液样品︰血浆、血清按照常规方法制备后可以直接用于该试剂盒的测定，-20℃冻存，用于苯丙氨酸解氨酶的检测。

③细胞或组织样品∶取恰当细胞或组织裂解液，如果有必要需进行适当匀浆，4℃ 10000r/min离心15~20min，取上清液，-20℃冻存，用于苯丙氨酸解氨酶的检测。④高活性样品︰如果样品中含有较高活性的苯丙氨酸解氨酶，可以使用蒸馏水或PAL Lysis Buffer稀释进行恰当的稀释。

2、PAL加样∶

取96孔板，按照下表设置对照孔、测定孔，溶液应按照顺序依次加入，并

注意避免产生气泡。如果样品中的PAL活性过高，可以减少样品用量或适当稀释后再进行测定，样品的检测最好能设置2平行孔，求平均值。

3、PAL检测︰

以对照孔为对照(调零)，酶标仪立即测定290nm处测定孔的吸光度(记为   A_测定0);40℃准确孵育1h，立即加入10μl PAL终止液终止反应(备选方案)，以对照孔为对照调零，酶标仪立即测定290nm处测定孔的吸光度(记为A_测定1)。

注意︰加入PAL终止液终止反应为非必须步骤，可37℃准确孵育1h后直接以对照孔为对照调零，酶标仪立即测定290nm处测定孔的吸光度。

计算:

PAL活性单位的定义︰在该实验条件下，每小时吸光度变化0.01所需酶量为一个活性单位。

组织样品PAL(U)={(A_测定1-A_测定0)×V_T}/(W×V_s×0.01×t)

液体样品PAL(U)=(A_测定1-A_测定0)/(0.01×t)

式中:

A_测定1=40℃孵育1h后测定孔的吸光度

A_测定0=加入PAL Assay buffer后立即检测的测定管吸光度

W=组织样本的重量(g)

V_T=提取酶液的总体积(ml)

V_s=测定时所用酶液体积(ml)

t=反应时间(h)=1

注意事项∶

1、待测样品中不能含有酶抑制剂，同时需避免反复冻融。

2、获得上清液为PAL酶液，应尽快检测，亦可-20°℃保存。

3、如果没有可测定紫外区的酶标仪和酶标板，也可以使用紫外分光光度计和石英比色皿，但应注意比色杯的最小检测体积。

4、每次检测指标不宜过多，否则操作时间不一，有可能导致样本间的差异。5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

有效期:6个月有效，4℃运输，4℃保存。