层析过程中色素的去除

溶液外观对注射用的原料来说是必检项目，其通常包括液体的透明度、浊度和颜色。在生物制剂制造过程中，由于培养基及金属工艺设备的接触，使得色素存在于蛋白质中间体和最终样品原液中，这在高浓度蛋白溶液中尤为显著。

蛋白溶液的外观在产品放行检测时是一个重要的质量参数。《欧洲药典》对人用单克隆抗体颜色做出了要求，即人用单克隆抗体的液体制剂是“透明或略带乳白色，无色或略带颜色的液体”[1]。这也是国际人用药品注册技术协调会(ICH) Q6B放行规范中规定的检测项。颜色异常意味着产品可能被污染或已降解，所以色素的控制和去除是蛋白生产过程中非常重要的环节。提前了解色素的控制和去除方法对于新药或仿制药的质量标准起草和申报都非常有帮助。

影响蛋白溶液颜色且难以去除的色素主要是由培养基组分在培养和收获过程中与蛋白分子结合或导致蛋白分子变性时产生的。对颜色影响最大的是维生素B和铁离子，比如哺乳动物细胞培养基中的常添加的CN-B12在光照条件下转化为OH-B12之后与抗体分子结合导致粉色[2]；铁离子浓度会增加蛋白药物原液的颜色和酸性变异体。

铁离子不会直接引起蛋白原液的变化，会因芬顿反应产生活性氧（ROS），使蛋白质发生氧化，导致蛋白质中的色氨酸氧化成N-甲酰犬尿氨酸(浅黄色)和犬尿氨酸(棕黄色)[3,5]。

细胞培养过程中产生的几种高级糖化终产物(AGE)是有颜色(黄褐色)和荧光的。AGE的结构及其形成途径复杂多样，但都源于还原糖或碳水化合物氧化降解的二羰基副产物与蛋白质赖氨酸或精氨酸的氨基侧链反应[3]。

毕赤酵母诱导中后期，AOX1醇氧化酶释放进入发酵液，结合黄素腺嘌呤二核苷酸 (FAD) 辅因子形成八聚物导致绿色[4]。

另外，天然互作蛋白以及小分子色素等，也可能会引入颜色。

蛋白溶液颜色的控制

在蛋白生产过程中，细胞株构建、上游培养、层析纯化这三个阶段都能对色素进行有效的控制和去除。尤其在纯化阶段，层析介质可以有效去除样品中的多种色素。

细胞株构建阶段

不同的细胞株对铁离子和维生素B12的吸收和需求量有所不同，如果选择对铁离子和维生素B12消耗速率快或含量要求低的细胞株，使其培养液中的铁离子和维生素B12含量降低，产生异常颜色的概率会降低。

上游培养阶段

适当优化培养基的组分，比如抗体生产中可以适当调整培养基中的高氧化性组分（如铁离子）和光敏感性成分（如B族维生素等）的含量。

在细胞培养工艺开发中，通过优化金属离子或者其它添加剂的含量，可能会导致蛋白显色，建议尝试不同类型的培养基，适当减少这些成分的用量，并通过筛选高产细胞株或长期传代驯化，保证产量。

层析纯化阶段

色素的种类特别多，大分子、小分子的，带正、负电荷的，疏水、亲水的等。层析纯化适用于去除一些与蛋白质不结合或者非共价结合的色素去除，对于一些与蛋白共价结合的色素（如OH-B12与半胱氨酸残基的结合），则需要优化培养条件，在上游培养阶段进行控制。如果不清楚溶液中色素的性质，可以尝试不同的层析方法。

• 亲和层析

亲和层析多为蛋白纯化捕获阶段，通过优化缓冲液体系以破坏色素与填料之间的离子型吸附及非特异性吸附，在对蛋白进行富集的同时可有效去除色素。

• 离子交换层析

如果色素与目的蛋白分子量上有明显差异，可使用凝胶过滤进行去除，例如通过脱盐柱进行缓冲液置换及精纯阶段高分辨分子筛除杂时，色素在一定程度上可被去除或被吸附。

案例分享：动物源体外分泌酶中色素的去除