22RV1是来自异种移植(在阉割引起前列腺癌衰退又在其Father的雄性激素信赖型CWR22嫁接后复发的小鼠中连续传代)的人前列腺癌上皮细胞系[1]。此细胞系表达前列腺特异抗原PSA。二羟基睾丸脂酮可轻微刺激细胞生长，经Western Blot检测溶解产物与抗雄性激素受体抗体起免疫反应。EGF可刺激细胞生长，但TGFβ-1不能抑制细胞生长。该细胞在裸鼠中成瘤。近年来，研究表明22RV1产生高滴度的人类逆转录病毒XMRV(异嗜性小鼠白血病病毒相关病毒)。细胞特性形态上皮样细胞单层贴壁生长倍增时间~40 hours抗原表达前列腺特异性抗原（PSA）表达标志物雄激素受体生长培养基RPMI-1640＋10% FBS＋1% P/S培养注意事项1、该细胞有密度依赖，传代比例不宜超过1：4；2、细胞复苏时需要离心去除DMSO，离心接入皿中，静置两天，保持培养箱环境稳定。冻存细胞复苏最初阶段，贴壁量少，成簇松散贴壁，但是最终细胞会变平，并且扩散成很好的单层，这个过程需要4-5天时间；3、细胞冻存后复苏成活率不高，推荐冻存液配比为90%血清+10% DMSO；4、细胞生长缓慢，细胞只能生长到90%的汇合度传代步骤1、吸出原培养液；2、加入2mL左右PBS，轻轻晃动培养瓶润洗细胞，吸出PBS丢弃；3、加入1mL左右胰酶，轻轻晃动培养瓶使之浸润所有细胞；4、放入培养箱消化，消化2- 3分钟左右，显微镜下看到细胞块中间的细胞明显分离变圆且自然脱落（细胞一定要彻底消化下来，全程不要拍打培养瓶）；5、加入3mL含血清的培养基终止消化，轻轻/反复吹打细胞，在显微镜下观察，细胞尽量呈单颗细胞的悬浮液；；6、收集细胞悬液离心，1000-1200rpm（250-300g）/min，3-5分钟，离心完吸出上清丢弃；7、加入新鲜培养基，吹打几下混匀细胞即可，按需接种到新培养瓶，补足足量培养基，拧松瓶盖或使用透气瓶盖进行培养；8、检查培养箱二氧化碳，温度和水盘。 换液步骤1、吸出旧培养基并沿培养瓶侧边（非培养细胞容器底部）添加新的培养基；2、每2-3天换液一次； 传代比例和频次细胞长满80%后，按照1：2的比例传代，2-3天可再次生长到80%；1：3传代，再次长满到80%需要3天以上的时间。 细胞正常生长图片

细胞培养总会遇到细胞污染、胞质疏松，状态不好，养不起来，等等问题。今天小编为大家分享一下细胞运输过程中容易出现的一些常见问题分析。 1. 细胞到货后发现脱壁现象，正常吗？如何处理？· 细胞脱壁的原因① 细胞本身的特性（293T，Lncap ，RAW264.7，PC12，SHSY5Y)② 气温过低③ 快递碰撞 常温运输的C2C12细胞收货时发现脱落 常温运输的Hela细胞收货时发现脱落· 处理方法① 脱落的细胞进行离心收集，并在离心管中消化。② 仍然贴壁的细胞，按照常规方法加入胰酶或其他解离剂消化。③ 再将消化好的脱落细胞和贴壁细胞混合，按比例接种到新的培养器皿中。  2. 细胞到货后发现皱缩现象，正常吗？如何处理？· 细胞皱缩的原因① 路途颠簸② 温度不稳定SHSY5Y细胞发货前细胞状态 SHSY5Y常温运输后客户收到的状态: 皱缩或脱落· 处理方法① 放入培养箱静置2-4小时。② 若4小时后仍然没有伸展，延长静置时间。注意：过夜静置时，需倒出部分培养基，留5-10mL在瓶中，瓶盖拧松透气，保持气体交换（L15培养体系除外） SHSY5Y细胞处理第三天 3. 发现细胞有很多小黑点，正常吗？如何处理？· 细胞产生小黑点的原因① 当受到运输环境影响时，细胞会发生应激反应，分泌活动增加，导致分泌蛋白增多，呈黑色圆球状，分布无规律。② 路途中凋亡的细胞碎裂后将产生细胞碎片，为黑色或透明色，呈不规则状，分布无规律。③ 有些细胞本身分泌活动较强，培养时常伴随黑点。· 处理方法① 贴壁细胞放培养箱静置2-4小时后，正常换液或传代。② 悬浮细胞800~1000rpm（约160~200g） 低速离心3min去除碎片。通常培养数天后，细胞状态会逐渐稳定下来。小黑点和微生物污染的区别细胞碎片/分泌物微生物污染形态大小不一的黑色圆点，或不规则形状圆球状或杆状，形态非常规则是否运动原地震动，布朗运动或相对液体静止快速游动，快速转圈或相对液体静止分布情况视野中分布无规律视野中分布均匀增长情况无抗生素条件下不增多或缓慢增多无抗生素条件下48-72小时内爆发式增多 4. T25瓶内充液培养基可以继续使用吗？细胞种类不同，细胞的运输液不同。培养瓶内为完全培养基可以继续使用！培养瓶内为维持培养基不可继续使用！生物培养瓶上都有明显的标识注明，请一定要按照培养瓶上的标识来判断培养瓶内培养基是否可以继续使用。 5. 什么情况下可以免费重发细胞？① 超过7天未送达。② 外包装破损、漏液（需提供照片）。

收到细胞还未开封，疑似污染，应当如何处理？当您收到细胞后，首先观察并拍照记录细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，干冰运输的细胞检查干冰是否完全挥发，细胞是否解冻，若有上述现象发生请及时和我们联系。如询问后确定无明显污染，请按随货细胞说明书正常操作处理即可。温馨提醒确认细胞无污染，观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁，将T25瓶置于37度培养箱放置2-4h，以便稳定细胞状态，把静置完成后，取出细胞培养瓶，镜检、拍照(当天以及第 2,3 天请拍照)，记录细胞状态 (所拍照片将作为后续服务依据)；建议细胞传代培养后，定期拍照、记录细胞生长状态，方便后续售后服务。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和我们联系，告知细胞的具体情况，以便我们的技术人员跟踪回访直至问题解决。

细胞培养基是人工模拟细胞在体内生长的营养环境，是提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。培养液或培养基的含义几乎相同，英文都是medium。当它是粉剂时，倾向性地称为培养基，而将粉剂配成液体后，多称为培养液。培养液中常常补加血清、抗生素等成分。 细胞培养基是细胞培养的基础，它为动物细胞的健康快速成长提供营养物质。所以只要用到细胞来制造生物技术产品，细胞培养基的重要作用就无可替代。   那么我们在细胞培养中常用的培养基有哪些呢?   1、RPMI-1640 Medium    RPMI-1640广泛应用于哺乳动物 、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培养。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。 2、Minimum Essential Medium(MEM)    也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alpha一般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。   3、DMEM-高糖(标准型)    一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。   4、DMEM-低糖(标准型)    一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。   5、DMEM/F12    DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基(DME/F12medium)，作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12(1：1)中加入15mMHEPES缓冲液。   6、McCoy’s 5A    McCoy’s 5A Medium 主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种(如骨髓、皮肤、肺和脾脏等)的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。   7、Iscove’s Modified Dulbecco Medium (IMDM)    Guilber 和Iscove将Dulbecco’Medium 改良为 Iscove’s Medium，用于培养红细胞和巨噬细胞前体。此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES。并用potassium nitrate取代了Ferric nitrate。IMDM还能够促进小鼠B淋巴细胞，LPS刺激的B细胞，骨髓造血细胞，T细胞和淋巴瘤细胞的生长。IMDM为营养非常丰富的培养液，因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。   8、M-199 Medium    1950年，Morgan成功研制出具有确定化学成分的细胞培养液，即M-199，主要用于鸡胚成纤维细胞培养。此培养液必须辅以血清才能支持长期培养。M-199可用于培养多种种属来源的细胞，并能培养转染的细胞。   9、Leibovitz Medium (L-15)    L-15培养液适用于快速增殖瘤细胞的培养，用于在CO2缺乏的情况下培养肿瘤细胞株。此培养液采用磷酸盐缓冲体系，氨基酸组成进一步改良，并由半乳糖替代了葡萄糖。   10、Ham’s F-10培养基    适应小鼠细胞、人类二倍体的培养。   11、Ham’s F-12培养基    可以在加入很少血清的情况下应用，特别适合单细胞培养和克隆化培养，是无血清培养中常用的基础培养液。   12、William’s Medium E    用于大鼠肝上皮细胞的长期细胞培养。   13、MCDB 131 培养液    用于培养内皮细胞。   14、Opti-MEM I Reduced Serum Media    用于培养造血细胞。   15、植物血凝素(PHA)    增加细胞转化和DNA合成。

细胞百科               原代细胞（primary culture cell）英文名称：primary culture cell过程：经胰蛋白酶等消化、分散特点：快慢及难易程度不一传代：除了部分终末分化的细胞，一般的细胞都能传代6-8代及以上应用：药敏试验、细胞分化等实验研究 原代细胞(primary cell)是指从机体取出后立即培养的细胞。有人把培养的第1代细胞与传10代以内的细胞统称为原代细胞培养。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株(系)研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。原代细胞在生物医药领域有不可替代性作用，市场前景广阔。  中文名称原代细胞英文名称primary culture cell特点快慢及难易程度不一过程经胰蛋白酶等消化、分散传代除了部分终末分化的细胞，一般可以传代应用药敏试验、细胞分化等实验研究原代细胞定义原代细胞（primary culture cell）是指从机体的组织（如人组织、小鼠组织大鼠组织和兔组织等）经蛋自酶或其它的方法获得单个细胞并在体外进行模拟机体培养的细胞，称为原代细胞。原代细胞生长缓慢，一般认为，培养的原代的第1代细胞和传代到第10代以内的细胞统称为原代细胞培养。原代培养的细胞一般传至10代左右就不容易传下去了，细胞的生长会出现停滞，大部分细胞衰老死亡。在人工条件下使其原代细胞生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题的研究。原代细胞是接近和最能反映体内生长特性的细胞，适用于药敏试验、细胞分化等实验研究。研究中常用的细胞系/株系是现成的，我们只需要进行细胞传代和种子保存。然而，这些细胞系往往因长期体外培养而失去原有的生物学特性，对药物治疗的反应差距越来越大。因此，越来越多的人选择原代细胞。来源于胚胎、组织、器官和外周血，经特殊分离方法制备的原代培养细胞称为原代细胞。原代细胞培养，也称为原代培养，是从供体获得的组织细胞在体外的培养。动物组织经胰蛋白酶等消化、分散，获得单个细胞，再生长于培养皿中。大多数组织可以制备原代细胞，但生长的快慢及难易程度不一。肾和睾丸最常用，甲状腺细胞生长较慢，只用于某些特定的病毒如猪传染性肠胃炎病毒的培养。这类细胞生命周期有限，在有限的生命周期内需掌握好细胞的生长空间，以保持细胞群中基因型和表型的一致性。原代细胞的共性原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株(系)研究、DNA, RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。原代细胞在生物医药领域有不可替代性作用市场前景广阔。除了部分终末分化的细胞，一般的细胞都能传代6-8代及以上，有些细胞基至更多，但是一般都建议采用3-4代以内的细胞。在原代细胞培养过程中，-般是初次培养过夜后换液，以后每隔2-3天换一次液，以培养液的颜色为标准，一般变黄后就需换液。原代细胞的传代前期一般是3-4天传一次代，后期一般是4-6天传一次代(前期指前三代，后期指三代后)。不同类原代细胞的特性1.终末分化的细胞心肌细胞、型肺泡细胞(上皮细胞)、小脑颗粒细胞(神经元)、脂肪细胞、角质形成细胞。终末分化细胞无增殖能力，建议使用新鲜的原代细胞。2.上皮类细胞血管内皮、肾小球内皮细胞、气道上皮、结肠直肠上皮、小肠上皮、子宫颈上皮、胰腺导管上皮、肾上皮、肾小管上皮、前列腺上皮、乳腺上皮、甲状腺上皮、角膜上皮细胞等。上皮类细胞大多都能增殖传代6-8代，但多数上皮类细胞的生长伴随着成纤维细胞的大量增殖，3-4 代后成纤维细胞成为优势细胞，建议使用原代或者3-4代以内的传代细胞。人体组织来源的上皮类原代细胞增殖能力较弱，建议选用原代细胞进行实验研究。3.嗅球成鞘细胞属于神经胶质细胞，可增殖传代，体外培养3-4代后成纤维细胞成为优势生长细胞，建议使用原代或者3-4代以内的传代细胞。4.骨骼肌、平滑肌细胞可增殖传代，至少10-12代 。5.成骨细胞、关节软骨细胞可增殖传代，至少6-8代，但其生长伴随有成纤维细胞的污染，3-4代后成纤维细胞成为优势生长细胞，建议使用原代或者3-4代以内的传代细胞。6.角质细胞、黑素细胞均取自动物表皮，角质细胞易分化，原代培养6-7天后逐渐分化并死亡。表皮组织中黑素细胞含量较少，原代培养的黑素细胞可增殖传代，至少6-8代，3-4代后成纤维细胞成为优势生长细胞，建议使用原代或者3-4代以内的传代细胞。7.胰岛细胞可增殖传代，至少8代，但其生长伴随有成纤维细胞的污染，3-4代后成纤维细胞成为优势生长细胞，建议使用原代或者3-4代以内的传代细胞。8.肝细胞原代培养的肝细胞不易增殖，建议使用新鲜的原代细胞。 原代细胞分离人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来。1.悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟。经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。2.实体组织材料的分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。① 机械分散法特点：简便、快速,但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差,适用于处理纤维成分少的软组织。② 消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。Ⅰ酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶(Corning 25-053-CI)和胶原酶(Sigma/Life)胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开。胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶、弹性蛋白酶、木瓜蛋白酶Ⅱ非酶消化法(EDTA消化法)EDTA是一种非酶消化物，又称螯合剂或Versene，全名为Ethylenediaminetetraacetic acid。常用不含钙、镁离子的PBS配成0.02%的工作液，对一些组织，尤其是上皮组织分散效果好，该化学物质能与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞或使贴壁细胞从瓶壁上脱离。Ⅲ 消化分离法的操作步骤剪切，加液漂洗，消化，弃去消化液，漂洗，机械分散Ⅳ 消化分离法的注意事项组织块必须漂洗2-3次以除去组织中的钙、镁离子和血清对胰蛋白酶和EDTA的抑制作用。胰蛋白浓度不宜过高，作用时间不能太长，以避免毒性作用。消化后组织不仅要尽量弃去消化液，以避免毒性产生，而且动作要轻，避免膨松的细胞随漂洗而丢失。 原代细胞的培养原代细胞的培养是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。因此，较为严格地说是指成功传代之前的培养，此时的细胞保持原有细胞的基本性质，如果是正常细胞，仍然保留二倍体数。但实际上，通常把第一代至第十代以内的培养细胞统称为原代细胞培养。 [1] 最常用的原代细胞的培养有组织块培养和分散细胞培养。组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。分散细胞培养大致步骤为：将动物组织从机体中取出离散成单个细胞(常用胰蛋白酶)，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖(注意整个过程无菌)。原代培养是直接从生物体获取细胞进行培养。由于细胞刚刚从活体组织分离出来，故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段，同时也为以后传代培养创造条件。利用此方法还可直接服务于临床实践。例如，用从手术中切除的肿瘤细胞进行原代培养，然后用该培养细胞进行抗癌药物的筛选，根据肿瘤细胞对加入的化疗药物的敏感性来帮助选择最有效的化疗方案，有可能起到增强疗效、降低副作用的作用。原代细胞的复苏1.取出细胞，迅速放入37℃温水中快速解冻。2.吸出细胞悬液，并加10倍以上培养液。3.用培养液适当稀释后接种培养瓶，放入37℃ CO2 培养箱静置培养。原代细胞的培养其实与细胞系的培养无多大差别，针对不同的细胞会选择不同的细胞培养液。1.培养液选择 根据不同的细胞类型和实验 要求进行培养液的选择，最常用的L/H DMEM, F12 DMEM, RPMI 1640。加液：培养液不能浸没组织块，避免组织漂浮。然后培养4h左右加培养液，培养48h后换液。a.培养时间无论是酶消化法还是组织块法，取样后培养时间最少需要一周以 上的时间，期间可换液或者传代。b.换液时间无论酶消化法还是组织块法，在培养期间需要随时关注细胞的生长状况，需观察其是否贴壁，是否污染，组织块法要观察是否有细胞迁移出来。正常情况下48~72h可换液一次。2.细胞状态判断正常贴壁细胞在培养几天后，会逐渐贴满整个瓶底或者皿底，有的呈纤维状，有的呈多边形。下图均为比较健康的原代细胞图左: 小鼠成纤维细胞；右:鸡胚成纤维细胞人成纤维细胞图这些细胞的状态比较好，生长至80%~90%融合就可以传代。 原代细胞的传代、保存传一代后的细胞(也可以不传代直接冻存)培养至80%~90%便可冻存起来供后续实验用。冻存液配制:不同的细胞可能会有不同的冻存液配制方案，各实验室也有自己的冻存方案，常见的方案有:A: 10%DMSO+90%FBSB: 10%DMSO+40%FBS+50DMEMC: 5%DMS0+45%DMEM+50%FBS 按下列顺序降温：室温→4℃(20分钟)→冰箱冷冻室(30分钟)→超低温冰箱(-80℃ 过夜)→液氮。D：无血清冻存液传代：依椐细胞的生长状态，生长的细胞1：2或1：3进行传代。细胞培养过程无菌操作正常的复苏，换液和传代操作，最后将培养好的细胞进行相应的实验即可细胞鉴定有时候我们获取的原代细胞可能会有不是自己期望的细胞在里面，或者获取的不是我们的目标细胞。这个时候我们需要进行细胞的鉴定。细胞鉴定需要购买特定细胞的表面标志物抗体或者染色试剂进行鉴定。原代细胞试用的实验类型原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株(系)研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。在这些应用中几乎都涉及了几个最常见的且最基础的细胞实验，如下:1.细胞增殖检测常见检测方法: CCK8检测法，MTT检测法，Brdu检测法， Edu检测法， 平板克隆形成2.细胞周期检测常见检测方法:流式检测细胞周期，标记有丝分裂百分率法3.细胞凋亡检测常见检测方法:流式检测细胞凋亡，线粒体膜电位，活性氧检测，Hoechst染色， 电镜，TUNEL4.细胞转移能力检测常见检测方法:细胞划痕实验，Transwell实验， Invasion实验

细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。利用冻存技术将细胞置于-196℃liquid nitrogen中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。但一些科研老师可能会遇到冻存的细胞复苏活率低、细胞复苏后难以贴壁等问题，那么碰到这些问题该如何处理呢？细胞冻存复苏常见问题 问题一：为什么细胞解冻后缺少活力，活细胞占比较低？这种现象可能主要由以下几种原因所导致1.培养物冻存液等质量欠缺解决方案a.确保用来制备储存物（冻存液）的起始培养物需要保证其健康、无微生物污染、处于生长对数期后期状态。b.收获细胞时需要小心翼翼，避免细胞损伤。2.储存物冻存方法不当解决方案a.在liquid nitrogen冷冻细胞时，确保细胞、培养基和其他试剂的浓度，以及冻存实验步骤依照供应商的建议。一般来说，冻存应该缓慢，大约1-3° C/min以减少冰晶形成。b.使用电子可编程或机械冷冻装置以确保一致的、适当速率的冷冻。c.选择最合适的细胞冷冻保护剂。如果使用甘油，不要将其存储在光照下，因为曝光会使甘油转化为有对细胞毒性的acrolein。3.储存物保存不当解决方案a.储存物应时刻保持在-130℃，理想情况是置于liquid nitrogen中，以确保较大的细胞活性。b.如果将细胞直接浸入liquid nitrogen中，容易造成liquid nitrogen泄露到冻存管内，解冻时会有冻存管爆炸的风险。所以一般储存在liquid nitrogen上方的气相环境中。4.细胞解冻方法不当解决方案a.一般来说，细胞应该快速解冻、使用预热的培养基、尽快移除含有冷冻保护剂的培养基防止细胞活力下降。b.确保小心操作细胞。不要涡旋或高速离心，因为低温保存后的特别容易受到损伤。问题二：细胞进行解冻或传代后细胞的附着力偏低？这种情况主要是因为湿度过低致使培养容器上集聚静电所致。可以通过适当增加房间湿度，使用防静电装置或者用消毒过的湿毛巾擦拭培养容器外侧，来减低静电产生。另外试剂混合不均匀，培养瓶转速等因素也可导致此现象发生。所以在进行细胞培养时，要确保细胞和所有试剂的溶液混合充分。在使用振荡培养箱进行细胞培养时，注意设置适宜的转速。问题三：为什么细胞复苏后，很多难以贴壁？忽略培养基的问题，主要考虑细胞冻存时状态差或者复苏时动作太慢导致细胞死亡。切记最重要的融化速度要快，可不时摇动冷冻管，使之尽快通过最易受损的温度段（-5～0℃）。问题四：为什么细胞贴壁了，却长不起来？此时需要考虑的是细胞密度问题，一些细胞倾向于维持一定的密度，若复苏的细胞生长缓慢，可将细胞转移到较小的培养瓶/皿中培养。问题五：收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，是因热胀冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出liquid nitrogen桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。问题六：冷冻管应如何解冻？将冷冻管由liquid nitrogen桶中取出解冻时，必须注意安全，可佩戴防护眼镜和手套预防冷冻管的爆裂。取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水浴环境中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。问题七：细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？现在大多数实验室会在解冻细胞后加培养液将DMSO除去，但也有研究者认为除少数特别注明对 DMSO 敏感的细胞外，绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，可直接放入含有 10~15ml新鲜培养基的培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除 DMSO 即可，如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附的问题。问题八：细胞冻存为什么要添加保护剂？细胞冻存是将细胞放在低温环境，减少细胞代谢，以便长期储存的一种技术，细胞在不加任何保护剂的情况下冷冻，细胞内外的水分会很快形成水晶从而引发一系列的不良反应。首先，部分蛋白质因局部电解质浓度增高和pH值改变而变性，导致细胞内部空间结构发生改变。其次，细胞内冰晶的形成和细胞膜系统上蛋白质，酶的变性等会限碍细胞的能量代谢。再次，胞膜上的类脂蛋白复合体在冷冻中易发生破坏引起胞膜通透性的改变，使细胞内容物丧失。最后，随着冷冻温度的降低，冰晶体积膨胀造成DNA的空间结构发生损伤从而引起细胞死亡。添加冷冻保护剂可以很好的改善细胞的破坏与死亡情况。问题九：高效进行细胞冻存应该注意什么？1.缓慢冷冻：慢冻可使细胞逐步脱水，细胞不会因产生大的冰晶而受到损害。相反，细胞内若出现大结晶会引起细胞膜、细胞器的损伤和破裂。2.细胞活力及浓度：细胞应在生长良好、致密度约为80-90%活力达90%以上的状态下冻存。细胞活力差的细胞在冻存后的成活率很小，因此，一定要在细胞旺盛分裂时期冻存。3.冻存密度：冻存时细胞密度少于5x105个活细胞/mL时，很难成功复苏。4.冻存管盖子：冻存管的盖子一定要拧紧，否则水浴复苏时水会渗入造成污染。5.冻存时间：细胞不可长期保存在-80℃冰箱中。建议在-80℃冰箱中的保存时间不要超过48h。问题十：细胞冻存和复苏的最佳时间是什么时候？细胞在体外生长期间，通常分为三个阶段：潜伏期、指数生长期和平台期。潜伏期通常是细胞刚刚传代，此时细胞开始贴附基质和伸展骨架，代谢活动集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表达，细胞量在这段时间内几乎没有增加。随后，细胞开始指数生长期，核酸转录翻译旺盛，DNA解旋、配对频繁，胞内物质传递迅速，细胞数量迅速增长。如果在这个时期冻存，实际上是强行将细胞冻结在代谢的某一时刻，势必造成对解旋的DNA、转录翻译中的RNA和蛋白的机械损伤，增加个环节发生错误的风险。有著细胞数量的增长，培养容器内，细胞汇合达到90%以上。大部分细胞因为“接触抑制”而停止高速代谢和增殖，胞内活动趋于平缓。所以，建议在刚刚进入平台期时冻存细胞，既可以获得足量的细胞，也不会对细胞造成过多的机械损伤。问题十一：细胞在liquid nitrogen中可以保存多久？细胞冻存可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，细胞储存在liquid nitrogen中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。为妥善起见，特别是很多未被冻存过的细胞在首次冻存后要在短期内复苏1次，观察细胞对冻存的适应性。已建系的细胞最好也每年复苏1次后，再继续冻存。问题十二：目前细胞冻存液多采用的什么配方？目前细胞冻存多采用DMSO二甲基亚砜或甘油作保护剂，细胞冻存液的配方有很多种，如培养基：血清：DMSO=7:2:1或8：1：1或5：4：1，或直接用血清：DMSO=9:1，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，复苏存活率在80%～90%以上。澳睿赛即用型细胞冻存液，直接冻存于-80℃冰箱，长期保存（>5 年），不需要程序性降温，高安全性，病毒、病菌和支原体等污染可能性低，细胞存活率和活力高，批次性差异小。问题十三：若没有细胞冻存盒，我们该怎么办？可先将冻存管放入4℃冰箱中10min，再移至-20℃冰箱30min，-80℃冰箱2h或过夜，最后放入liquid nitrogen罐内。为了节约时间，还可直接在冻存盒外包裹一团棉花，用棉花代替冻存盒缓慢降温的特点，将细胞转移至-80℃冰箱过夜，再转移至liquid nitrogen保存。细胞复苏时会有一定的细胞死亡，因此细胞的浓度应足够高，起始浓度106—107个/ml/管。细胞冻存和复苏需要注意哪些 1.细胞本身的状态一般情况下细胞的复苏还与原代细胞的活性有关，如果要冻存的细胞悬液本身活性不高的话，后面复苏的存活率也不高。不要在细胞状态不好时，进行细胞冻存。如，长的太过了，培养液已经很黄了；细胞可疑污染；细胞已经开始凋亡或崩解;连续培养超过二个月，细胞性状已有改变。应该在增殖旺盛，情况稳定，实验效果良好，复苏后两周内进行细胞冻存。2.冻存细胞数量要足够无论你再怎么小心，细胞在冷冻和复苏的时候都是最脆弱的，总会死掉一批。所以，一开始就要保证冻存细胞的数量足够。冻存时细胞浓度低于1-5 ×106个/ml，很难复苏成功，应该离心后调整细胞浓度。3.慢冻快融一般情况下，细胞冻存时要遵循“慢冻快融”的原则。标准的降温速度是1-2℃/min ，当温度到达-25℃，降温速度可加快至5-10℃/min，到-80℃可直接入液氮。有些实验室是梯度冻存：4度，-20，-80，liquid nitrogen，依次冻存。而复苏速度越快越好。从liquid nitrogen罐里取出来之后，迅速放在37°C水浴中，尽快融化4.注意安全细胞冻存和复苏是细胞培养技术里面最容易出事的部分。凡是和liquid nitrogen接触的操作，注意戴保护眼镜和手套。注意：复苏的时候，在水浴中摇摇动的时候会有爆炸的可能性。另外， DMSO是有毒致癌的。接触的时候一务必要带好手套。5.做好标记对于冻存细胞，一定要做好标记。如：细胞名称、代数和冻存日期。特别是公共实验室，更要做好标记，避免找不到自己的细胞。6.DMSO是否去除由于DMSO是一种有毒致癌物质。那么，解冻之后，应不应该去除冻存液中的DMSO呢?答案是no。除了极少数特别注明的对DMSO敏感的细胞外，99%的细胞都不需要去除DMSO。后面细胞培养中频繁换液会慢慢去除掉DMSO。7.尽快转入liquid nitrogen冻存的细胞应尽快转入liquid nitrogen，不要在-80℃冰箱放置超过一个月。8.是否需要离心的问题关于细胞溶解后，是否需要离心的问题，需要根据特定的细胞情况而定。主要有两种方式。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后分装到培养瓶中进行培养，第二天换液（后贴壁后即换液）。因为离心的目的是两个，去除DMSO，去除死细胞，这个是标准流程。但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，死亡。此外在操作过程中容易污染。另一种是须离心后，将冻存液倒干净，且一定要倒干净。9.要有耐心有些细胞复苏后一星期才有起色，切忌要有耐心，不要换液，耐心等待，两周后再做决定。不要复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。复苏出现问题，以下 7 点需要自行检查 1.冻存的时候是不是消化的时间过长？太长的消化时间会让细胞复苏时失去贴壁能力，表现为先贴后死，原因是在你复苏的时候细胞已进入凋亡程序，不可逆转的死亡。2.冻存液好不好？是甘油还是DMSO，质量非常重要，否则也会死亡。3.你的冻存液的量加的是不是太多？4.冻存的时候是不是把 DMSO 混均匀?这个有一些影响，但不算太大。5.你的冻存是否按部就班，就是所温度梯度是不是把握严格?6.是否是细胞污染？7.细胞在冻存前是否过密？以上是澳睿赛生物整理关于冻存的细胞复苏活率低及细胞冻存注意事项。细胞储存在liquid nitrogen中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。在不加任何物质的条件下，直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。若向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞。储存在-130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的-5~0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜(DMSO)和甘油。 

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一、   程序冻存步骤  △（需梯度降温）1、 配置冻存液，冻存液推荐配比：55%（基础培养基）+40%(血清)+5%（DMSO）或90%胎牛血清+10%DMSO；推荐使用澳睿赛通用血清型程序冻存液，货号ORCPB0436；2、 制备好的细胞悬液计数，计算总细胞量；3、 细胞离心后尽量吸干净上清，离心转速1200rpm（250g）3min；4、 加入配置好的冻存液重悬，调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL；5、 分装入冻存管，一个冻存管分装1~1.5毫升；6、 推荐使用程序降温盒，分装好的冻存管转入程序降温盒后直接放入-80℃冰箱过夜；7、 如没有程序降温盒，则按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存，注意转移过程中要保冷，避免产生温差或冻存管融化；8、 从-80℃冰箱取出冻存管迅速转移到液氮长期保存。 △注意事项：1、 DMSO配制的时候会放热，一定要等冻存液冷却后使用，避免灼伤细胞；2、 细胞离心后尽量吸干净上清液，减少培养基残留，避免稀释冻存液；3、 不建议手动梯度降温，温度不稳定，容易降低存活率；4、 注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于最低刻度线；冻存5次后异丙醇需要更换一次，以免影响冻存效果；程序降温盒需恢复到室温以后才能继续使用，不能从冰箱拿出来直接使用；5、 细胞悬液加入冻存液以后尽量短时间的在常温放置，DMSO常温下对细胞损伤大，分装完成后立即转入程序降温盒放到-80度冰箱，不需要放4度；6、 -80度冻存过夜后可以转入液氮长期保存，转入液氮的过程需要对冻存盒进行保冷，不要长时间在常温暴露，避免冻存管融化；7、 若没有液氮罐，存放在-80度的时候一定要放靠里面的位置，避免开关冰箱导致温度不稳定。8、 细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存； 二、   非程序冻存步骤   △（需使用无血清冻存液）1、  冻存液丛冰箱提前拿出回温到室温，推荐澳睿赛无血清细胞冻存液，货号ORC90100；2、  制备好的细胞悬液计数，计算总细胞量；3、  细胞离心后尽量吸干净上清，离心转速1200rpm（250g）3min；4、  加入无血清细胞冻存液（ORC90100）重悬，调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL；5、  分装入冻存管，一个冻存管分装1~1.5毫升；6、  分装好的冻存管直接转入-80度冰箱过夜，不需要程序降温盒；7、  转入液氮途中需将冻存管做好保冷措施，避免直接暴露于常温，快速转入液氮罐进行长期保存； △注意事项：1、 由于没有使用冻存盒，在转入液氮的过程中一定要对冻存管做好保冷措施，不能直接用手拿，可以用干冰或者少量液氮保护后转移，操作过程注意安全；2、 转移过程要快，避免冻存管暴露于常温后融化；3、 若没有液氮罐，存放在-80度冰箱的时候一定要放靠里面的位置，避免开关冰箱导致温度不稳定； 三、   细胞复苏步骤1、  将水浴锅预热至37℃，准备好干净的一次性PE手套，一个无菌离心管内加入9ml无菌培养基；2、  将细胞从液氮罐中取出放入PE手套中，迅速没入水浴锅，摇晃冻存管加速溶解，以1分钟内全部溶解为宜；3、  在超净台中将复苏好的细胞液加入到装有新鲜培养基的离心管内，1200rpm/min 离心3分钟，离心完毕去掉上清；4、  用适量与细胞对映的完全培养基重悬细胞，接入到无菌容器中（培养瓶或培养皿），补充培养基到适宜，放入培养箱培养； △注意事项：1、 水浴锅的位置如果与液氮罐不是一个房间，需要对冻存管进行保冷后转移到水浴锅旁，避免路途细胞表面融化；2、 细胞溶解过程快速摇晃以加速溶解；3、 已溶解的冻存细胞尽量短时间的在常温存放，尽快离心去除DMSO；4、 贴壁细胞复苏24小时后观察，若密度达到80%，则正常传代；若密度不到80%则继续培养到48小时再换液；5、 悬浮细胞复苏3天内不建议离心换液；6、 对DMSO不敏感的细胞在复苏时也可不离心，减少操作步骤，也可降低污染的几率。将解冻的细胞悬液直接转移至T25细胞瓶内，补加新鲜培养基，放入温箱内培养。但培养12~24h后必须换新鲜的培养基，移除死细胞。