您不可不知的反相 hplc 流动相的选择

 在 HPLC 中，流动相是纯溶剂或混合溶剂以及带有固体改性剂的溶剂。色谱工作者可以针对 HPLC 的不同应用在数百种溶剂中进行选择。特定的选择通常受溶剂特性的影响，例如粘度、折射率、非腐蚀性、毒性、混溶性、透明度等。以合理的价格以足够的纯度商业供应也是重要因素。流动相中的溶剂强度或有机溶剂百分比控制分析物的保留时间。

一、什么是流动相？

      流动相是使分析物通过色谱柱的溶剂。分析物存在于适当的溶剂中，在样品制备后注入色谱系统。该溶剂不被视为新基质，因为它不会干扰分析。可以在样品制备过程中选择分析物的载体（溶剂）的性质，以满足特定要求，例如挥发性和与 HPLC 中流动相的混溶性。在反相色谱柱中，流动相比固定相更具极性。一般来说极性流动相是首选，因为分离表现出更好的重现性。

       分析物在流动相中的溶解度在色谱柱选择中也起着重要作用。对于溶于水或部分水性溶剂的化合物，选择反相 HPLC 不是问题，但对于不溶于极性溶剂的化合物，通常需要使用正相色谱柱。样品极性、固定相极性和流动相极性的评估对于色谱柱的选择也很重要。

二、流动相的一般选择要求： 

1.纯度：所有溶剂都应具有最高的纯度和质量。HPLC 级溶剂经过预过滤和纯化，在紫外线下具有最小的吸光度。因此，它们不含会在色谱图基线中产生假峰的杂质。缓冲液制备中使用的水具有最高纯度。去离子水通常含有痕量有机化合物，因此不推荐用于HPLC。

2.粘度：为了保持可接受的压降 (< 2500 psi) 和合理的流过HPLC色谱柱的流速，流动相粘度应尽可能低。较低粘度的流动相产生较窄的色谱峰。例如乙腈通常是反相 HPLC 的首选溶剂，因为它不仅粘度低于甲醇或异丙醇，而且具有良好的保留特性。 

3.沸点：如果涉及样品回收，沸点很重要，低沸点溶剂更容易从样品中去除。 

4.无腐蚀性：溶剂必须对 HPLC 系统组件无腐蚀性。

5.毒性：现在每个人都关心与实验室化学品相关的健康和安全风险。四氢呋喃可用作不稳定或稳定的流动相。不稳定的版本如果完全蒸发可能有爆炸危险，并且在不储存在氮气下时容易分解。稳定版本在用于检测的典型紫外线波长下具有高紫外线吸收率。

6.混溶性：并非所有HPLC溶剂都可混溶。如果混合了不混溶的溶剂可能会导致一些问题，例如不稳定的基线、波动的压力、高压等。异丙醇可与大多数常见的 HPLC 溶剂混溶。因此，在不确定最后使用的溶剂系统的情况下，它可以用来冲洗 HPLC 的流路。 

透明度（UV 截止）：流动相（无样品）必须在用于检测的波长下充分传输。一项研究表明，流动相吸光度在检测波长处通常应小于0.5。 

三、流动相制备：

      预混：流动相预混合是通过分别测量每种溶剂的体积并将它们合并到溶剂容器中来完成的。当有机溶剂与水混合时，会出现负混合体积。例如，准备1升的甲醇/水 (50:50)，在量筒中分别量取 500 毫升的甲醇和水，然后将它们混合在一起。由于溶剂在混合时会收缩，因此不宜将500毫升甲醇倒入1升容量瓶中并用水定容，因为需要超过 500 毫升的水。

      缓冲：含有酸性或碱性分析物的样品需要在流动相中加入缓冲液。pH 调节应单独在水性缓冲液中进行，即在将其与任何有机溶剂混合之前进行。应采取预防措施以防止缓冲沉淀的任何可能性。甲醇可与大多数缓冲液混溶。当磷酸盐缓冲液与乙腈 混合时，上限应为60-80% ACN，磷酸盐缓冲液的浓度应小于 15mM 以防止沉淀。2.5至3的酸性pH值是大多数制药应用的良好起点。这是由于大多数酸性分析物的电离受到抑制以及碱性分析物与硅胶基色谱柱上表面硅醇的相互作用最小。用于流动相制备的常见酸有磷酸、甲酸和乙酸。在整个梯度运行过程中，缓冲添加剂的浓度必须保持恒定。通常建议在流动相的水相和有机相中使用相同浓度的 TFA 或其他酸（吸收紫外线）以抑制梯度运行期间任何类型的基线偏移。

       另外，选择合适的流动相吸滤头（又称溶剂进样口过滤器)可有效滤除流动相中的固体颗粒杂质，但未经过滤的溶剂或溶剂瓶中生长的微生物都会降低溶剂入口过滤头的寿命和泵的性能，因此，需要定期清洗或更换溶剂进样口过滤器。

       今天恒谱生分享的知识先到这啦，希望对您的工作有所帮助！